□ 北京普贊生物技術(shù)有限公司 供稿

真菌毒素快速檢測技術(shù)

□ 北京普贊生物技術(shù)有限公司 供稿

真菌毒素，又稱霉菌毒素，是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物都有害。真菌毒素可通過飲食進(jìn)入人或動物體內(nèi)，引起人或動物的急性或慢性中毒，進(jìn)而損害機(jī)體，造成肝臟、腎臟及神經(jīng)組織等的傷害。

真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮赭曲霉毒素等。1960年，英國10萬多只火雞因食用被黃曲霉毒素污染的飼料而死亡，此事件發(fā)生后，真菌毒素才逐漸引起人們的重視。受全球氣候變暖、干旱等因素的影響，食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品受真菌毒素污染的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，世界各地對于真菌毒素污染的報道也日漸增多，玉米、小麥、大麥、花生等谷物以及干果、水果、中藥材、牛奶等都容易被真菌毒素污染。因此，為減少霉菌污染，真菌毒素檢測手段必不可少，本文全面介紹了真菌毒素的常規(guī)檢測和快速檢測方法。

真菌毒素的常規(guī)檢測方法

液相色譜或液質(zhì)聯(lián)用法：高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）具有分辨率高、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中使用較多的也是高效液相色譜法，其中反相高效液相色譜法較為常用，其流動相主要為甲醇、乙腈和水或三者組成的混合溶液。HPLC可結(jié)合多種檢測器，如紫外檢測器（uv）、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FLD）、質(zhì)譜檢測器（MS）以及電化學(xué)檢測器（EC）等。

薄層色譜法：又叫薄層層析法（Thin Layer Chromatography，TLC），1968年AOAC首次提出利用微柱、薄層色譜法測定花生和花生制品中的黃曲霉毒素，此后許多國家也采用此法作為標(biāo)準(zhǔn)方法，它也是我國的標(biāo)準(zhǔn)方法。TLC根據(jù)真菌毒素能在紫外區(qū)域發(fā)出特殊熒光的特點來檢測真菌毒素，樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮及TLC分離后，在特定波長紫外燈下照射，可觀察到熒光。

氣相色譜法：一種強(qiáng)大的分離技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各類物質(zhì)的精確定量檢測，但由于許多真菌毒素都是極性化合物，在進(jìn)入氣相色譜柱前需要采用一定的方式進(jìn)行衍生，因而其在真菌毒素檢測中的應(yīng)用并不廣泛，目前應(yīng)用氣相色譜法檢測最多的真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

真菌毒素的快速檢測方法

快速檢測真菌毒素一般采用免疫分析方法，此方法的理論基礎(chǔ)為抗原抗體的特異性結(jié)合，主要包括放射免疫分析方法（RIA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析法等。但因RIA需要使用同位素標(biāo)記，有放射性污染，并且需要用到專門的儀器，故而，酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析法應(yīng)用更為廣泛。

酶聯(lián)免疫技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯(lián)免疫法（ELISA），是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的免疫檢測技術(shù)，有直接法、間接法、雙抗體夾心法等。雖然ELISA有多種模式，但基本原理和操作方法是相同的。首先將抗原或抗體固定到某種固相載體上（現(xiàn)在多為酶標(biāo)板），并保持其免疫活性，然后將待測樣品和酶標(biāo)物（酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固定的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng)，再然后將沒有發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)洗去，最后加入酶的底物。底物在酶的催化下顯色，最終通過顯色程度進(jìn)行定性或定量測定。ELISA可把抗原抗體免疫反應(yīng)與酶的高效催化作用原理結(jié)合起來，因此具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、時間短、檢測限低等特點。

目前，市場上真菌毒素類酶聯(lián)免疫檢測試劑盒種類與規(guī)格繁多，樣品前處理方法也較為多樣化。北京普贊生物技術(shù)有限公司（以下簡稱“普贊生物”）自成立至今一直致力于真菌毒素快速檢測方法的研究，目前已成功研制出黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、T2毒素、赭曲霉毒素等酶聯(lián)免疫試劑盒。與其他同類產(chǎn)品相比，普贊生物的產(chǎn)品操作更為簡便快速，40分鐘左右即可完成樣品檢測并收集結(jié)果數(shù)據(jù)，回收率可達(dá)90%～110%，產(chǎn)品靈敏度和檢測限均處于國內(nèi)領(lǐng)先地位，尤其是黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，靈敏度可達(dá)0.01ppb。

圖1 酶聯(lián)免疫技術(shù)原理

免疫層析法：免疫層析法（immunochromatography）是近年來國內(nèi)外新興的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，通過免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。

目前，膠體金檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌毒素類物質(zhì)的檢測，其具有的低成本、操作簡便、快速準(zhǔn)確等特點已被用戶及國家相關(guān)部門認(rèn)可。組裝成條的膠體金檢測卡如圖2所示，在一長條形的背板上按從左至右的順序貼上樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜（NC膜）及吸水墊。NC膜上偶聯(lián)有待測物的抗原（測試線，test line，T線）以及二抗（對照線，control line，C線），將抗體偶聯(lián)納米級的金顆粒放置在金標(biāo)墊上。從樣品墊處滴加樣品，開始反應(yīng)后，隨著樣品液的流動，偶聯(lián)抗體的金顆粒流向抗原處，當(dāng)抗原抗體結(jié)合使偶聯(lián)的金顆粒聚焦到一定數(shù)量時，即可形成肉眼可見的紅色條帶。而當(dāng)加樣的液體中也含有待測物時，則固定在固相載體上的抗原與樣品中的抗原競爭性結(jié)合待測物抗體，從而使NC上聚焦的金顆粒數(shù)目減少，進(jìn)而使紅色條帶變淺直至無色。利用以上特性，可以在很短的時間內(nèi)檢測到ng/mL級的各種真菌毒素。

免疫學(xué)檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體的特異性識別能力，這也是檢測產(chǎn)品質(zhì)量好壞的根本技術(shù)。普贊生物經(jīng)過多年的不懈努力，不斷篩選、合成和優(yōu)化出各種真菌毒素類特異性抗原和抗體，并研制生產(chǎn)出相應(yīng)的真菌毒素類檢測卡，不僅具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡便等特點，而且無需任何儀器設(shè)備，結(jié)果判斷直觀可靠，適用于現(xiàn)場檢測。其中，黃曲霉毒素B1和M1檢測卡靈敏度可達(dá)到0.5ppb，赭曲霉毒素檢測卡靈敏度為5ppb，嘔吐毒素檢測卡靈敏度為200ppb，玉米赤霉烯酮檢測卡靈敏度為20ppb。

使用膠體金檢測卡進(jìn)行檢測時，大部分時間都用在樣品的前處理上，所以提高樣品前處理效率可以在很大程度上緩解檢測人員的壓力并降低成本。以食用油樣品為例，植物油容易受到黃曲霉毒素污染，其中又以花生油和玉米油更為嚴(yán)重，市場上黃曲霉毒素B1檢測卡檢測植物油時樣品前處理流程一般為樣品收集、提取液提取、氮吹、復(fù)溶、檢測，完成整個流程一般需要0.5～1小時，并需配備氮吹儀，此外復(fù)雜的前處理往往會導(dǎo)致檢測效果不理想。普贊生物針對這些問題研制出了食用油專用的黃曲霉毒素B1檢測卡，無需吹干復(fù)溶等處理，每個樣品處理只需2～5分鐘，具有精確度高、前處理簡單、檢測所需時間短等優(yōu)點。

圖2 膠體金檢測卡

展望

目前，國內(nèi)外都有各類真菌毒素快速檢測產(chǎn)品，從質(zhì)量和技術(shù)上講，國內(nèi)公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒和膠體金檢測卡與進(jìn)口產(chǎn)品的差距越來越小，甚至部分指標(biāo)已經(jīng)超越進(jìn)口產(chǎn)品，畜牧相關(guān)行業(yè)和監(jiān)管部門也已高度認(rèn)可了這兩類檢測產(chǎn)品。雖然大部分用戶的檢測需求得到了基本滿足，但是由于各類用戶待測樣品有所差異，所以檢測效果和效率仍不能得到最大程度的保證，也就是說單獨的檢測卡、試劑盒產(chǎn)品還不能真正解決用戶的檢測問題，合適且具有針對性的定制化服務(wù)水平仍待提高。