李洪濤，劉 昊，楊方軍，李艷秋，孫曉偉,△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

電針對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13和S100A12蛋白表達的影響*

李洪濤1，2，劉 昊1，楊方軍3，李艷秋2，孫曉偉1,2△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的:觀察電針對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表達的影響。方法:30只SPF級SD大鼠隨機分為空白組、模型組和電針組，注射4%木瓜蛋白酶復(fù)制大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，分別于造模成功后5周、7周，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量的變化。結(jié)果：模型組和電針組大鼠不同時間點膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量均較空白組明顯升高(P<0.05)；但電針組大鼠IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量較同時間點模型組明顯降低(P<0.05)。且電針組大鼠造模成功后7周，膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量較5周時有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而模型組大鼠兩個時間點比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：電針可能通過下調(diào)IL-1β、MMP-13和S100A12蛋白的表達，抑制炎性因子的釋放、阻止軟骨基質(zhì)的降解、調(diào)控機體的免疫應(yīng)答，進而保護受損的關(guān)節(jié)軟骨，促進關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎；電針；IL-1β；MMP-13；S100A12

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一種臨床常見病、多發(fā)病，是一種進行性和緩慢性侵犯負重關(guān)節(jié)的退行性膝骨關(guān)節(jié)疾病[1-2]。白介素-1β(IL-1β)是一種細胞因子，白細胞介素的一種，由活化的巨噬細胞所產(chǎn)生，主要參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化，在炎癥反應(yīng)中起重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，由軟骨細胞產(chǎn)生，主要降解細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原，參與軟骨破壞。促炎因子S100A12是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種鈣結(jié)合蛋白，與機體的炎癥反應(yīng)和免疫防御密切相關(guān)。有研究表明，IL-1β、MMP-13細胞因子能導(dǎo)致軟骨的降解[3]，在軟骨病理變化中起到重要作用[4]。而S100A12可通過增強細胞外基質(zhì)蛋白水解及自身免疫，參與骨性關(guān)節(jié)炎疾病的活動和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5]。三者在KOA 的病理過程中均起著重要的作用。

筆者前期的臨床研究與動物實驗發(fā)現(xiàn)[6-7]：電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎療效確切，能明顯緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、僵硬程度，提高其日常生活能力；電針亦能明顯改善膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度。因此，本研究擬通過動物實驗，觀察電針對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表達的影響，探討電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

將30只SPF級雄性SD大鼠[黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,SCXK(黑)20100027]，體質(zhì)量(300±20)g,隨機分為空白組、模型組和電針組；每組又分為造模成功后5周和7周兩個亞組(n=5)。

1.2 儀器及試劑

酶聯(lián)檢測試劑盒：IL-1β(Diaclone，670.040.096)、MMP-13(Mybiosource，MBS702112)、S100A12(Mybiosource，MBS731072)。電針治療儀(SDZ-Ⅱ型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 造模及模型成功標準

KOA大鼠模型的制備參照Pomonis JD[8]方法，分別于1天、4天、7天在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液。模型成功標準：采用Lequesne MG評分[9]于木瓜蛋白酶水溶液注射后2周，評估大鼠的膝關(guān)節(jié)情況，大于4分者表明模型制備成功。

1.4 干預(yù)方法

電針組：大鼠取穴：參照華興邦《大鼠穴位圖譜》[10]，局部取患側(cè)的犢鼻、內(nèi)膝眼、曲泉，遠端取患側(cè)的太溪。操作[6]：模型復(fù)制成功后，每天固定時間給予大鼠電針干預(yù)，取穴太溪穴、曲泉穴(接一組電針，同側(cè)相連，正極在上，負極在下)，內(nèi)外膝眼(接一組電針)，疏密波刺激(H1為3 Hz，H2為100 Hz,電壓為2 V),以下肢肌肉收縮引起肢體或針柄輕微顫動為宜，每日1次，留針30 min。

空白組和模型組：每天同時間點給予同電針組一致的固定束縛30 min。

1.5 IL-1β、MMP-13、S100A12酶聯(lián)測定

各組時間點干預(yù)結(jié)束后，抽取適量關(guān)節(jié)液，靜置1 h，7500轉(zhuǎn)/min，離心8 min，取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書進行IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量的檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD或者SNK法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中IL-1β蛋白表達結(jié)果

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)液中IL-1β蛋白含量較低，且造模成功后5周和7周IL-1β蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。模型組和電針組大鼠不同時間點膝關(guān)節(jié)液中IL-1β蛋白含量均較空白組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但電針組大鼠IL-1β蛋白含量較同時間點模型組明顯降低(P<0.05)。組內(nèi)比較：電針組大鼠造模成功后7周，膝關(guān)節(jié)液中IL-1β蛋白含量較5周時有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而模型組大鼠兩個時間點比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中IL-1β表達比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，★P<0.05;與造模成功后5周比較，☆P<0.05

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中MMP-13蛋白表達結(jié)果

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)液中MMP-13蛋白含量較低，且造模成功后5周和7周MMP-13蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。模型組和電針組大鼠不同時間點膝關(guān)節(jié)液中MMP-13蛋白含量均較空白組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但電針組大鼠MMP-13蛋白含量較同時間點模型組明顯降低(P<0.05)。組內(nèi)比較：電針組大鼠造模成功后7周，膝關(guān)節(jié)液中MMP-13蛋白含量較5周時有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而模型組大鼠兩個時間點比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中MMP-13表達比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，★P<0.05;與造模成功后5周比較，☆P<0.05

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中S100A12蛋白表達結(jié)果

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)液中S100A12蛋白含量較低，且造模成功后5周和7周S100A12蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。模型組和電針組大鼠不同時間點膝關(guān)節(jié)液中S100A12蛋白含量均較空白組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但電針組大鼠S100A12蛋白含量較同時間點模型組明顯降低(P<0.05)。組內(nèi)比較：電針組大鼠造模成功后7周，膝關(guān)節(jié)液中S100A12蛋白含量較5周時有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而模型組大鼠兩個時間點比較無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)液中S100A12表達比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，★P<0.05;與造模成功后5周比較，☆P<0.05

3 討論

KOA是由于力學(xué)和生物學(xué)因素共同導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變或膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，從而出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)功能障礙的一種慢性退行性疾病。IL-1β、MMP-13、S100A12是誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎病理過程中軟骨基質(zhì)降解和破壞的重要因子[11]。IL-1β細胞因子可促進軟骨細胞和滑膜分泌NO、前列腺素E2，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，從而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡,加重炎癥反應(yīng),加速軟骨基質(zhì)的降解[11]。同時IL-1β能夠抑制軟骨蛋白聚糖合成，從而降低II、IX 型膠原蛋白的復(fù)合，導(dǎo)致軟骨細胞代謝失衡和變形，引起軟骨退變。在膝關(guān)節(jié)炎癥刺激的作用下，軟骨細胞可分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，破壞了MMP-TIMP的動態(tài)平衡。而MMP13是MMPs家族中對裂解Ⅱ型膠原活性最強，Ⅱ型膠原又是組成軟骨細胞外基質(zhì)的最主要成分，MMP13參與了細胞軟骨的破壞，因此，MMP13表達水平與KOA患者癥狀、病程、軟骨破壞程度均呈正相關(guān)性[12]。另外，MMP13升高，導(dǎo)致膠原網(wǎng)受到破壞，亦使得軟骨細胞更容易受到炎癥因子的攻擊，形成惡性循環(huán)[13]。S100A12是新近發(fā)現(xiàn)的一種鈣結(jié)合蛋白，參與炎性細胞的激活、化學(xué)趨化和傷口的愈合等，是炎癥性疾病活動高度敏感的生物標志物[14]。有研究表明，S100A12的高表達可能通過增強細胞外基質(zhì)蛋白水解及自身免疫，參與骨性關(guān)節(jié)炎疾病的活動和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5]。代鳳雷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，血液及關(guān)節(jié)外組織中分泌的S100A12進入血液循環(huán)后，到達KOA患者的關(guān)節(jié)周圍組織如滑膜，則可促進滑膜炎的產(chǎn)生；并且患者骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度與S100A12 的表達水平成正相關(guān)。

本實驗通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表達，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量較低，而木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表達較空白組明顯上升。電針干預(yù)后，不同時間點膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量均較同時間點模型組明顯降低(P<0.05)；且隨著針刺次數(shù)的增加和治療時間的延長，造模成功后7周，膝關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量較5周時有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但仍高于空白組；而模型組大鼠兩個時間點比較無明顯差異(P>0.05)。筆者前期研究已證實[6]，電針能明顯降低關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度，能夠起到保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。而本研究結(jié)果表明，電針治療可以明顯降低KOA大鼠關(guān)節(jié)液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白的表達，因此，筆者推測電針治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，可能與其下調(diào)IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表達有關(guān)，從而抑制膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性因子的釋放、阻止軟骨基質(zhì)的降解、調(diào)控機體的免疫應(yīng)答，進而保護受損的關(guān)節(jié)軟骨、促進關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。

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ExpressionofIL-1β、MMP-13andS100A12ProteininJointFluidsofKneeOsteoarthritisRatsInfluencedbyElectro-acupuncture

LI Hong-tao1,2, LIU Hao1, YANG Fang-jun3, LI Yan-qiu2, SUN Xiao-wei1,2△

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To observe the effect of electro-acupuncture on IL-1β、MMP-13 and S100A12 protein expression in joint fluids of knee osteoarthritis rats.Methods30 SD rats were randomly divided into the blank group, the model group and the electro-acupuncture group. The models were established by injecting 4% papain. IL-1β、MMP-13 and S100A12 protein content in joint fluid were tested wtih Elisa method five weeks and seven weeks respectively after the establishment of successful models.ResultsThe levels of IL-1β, MMP-13, S100A12 protein content in the model group and electro-acupuncture group were significantly higher than those of the blank group at both time points(P<0.05); but those levels were significantly lower than those of the model group at the same time point(P<0.05); moreover, those levels of seven weeks after were lower than those of five weeks after, and the difference was statistically significant(P<0.05); however, there was no statistical significance between the seven weeks after and five weeks after in the model group(P>0.05).ConclusionElectro-acupuncture may promote the recovery of the structure and function of arthrodial cartilage by down-regulating the expression of IL-1β, MMP-13 and S100A12 protein, inhibiting the release of inflammatory factors, preventing the degradation of cartilage matrix, regulating the immune response of the organism.

Knee osteoarthritis; Electro-acupuncture; IL-1β; MMP-13; S100A12

R246.2

A

1005-0779(2017)09-0057-03

黑龍江省科學(xué)基金項目,編號：H2017058;黑龍江省博士后資助項目,編號：LHB-Z12265。

李洪濤(1979-)，男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在站博士后研究人員,研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療骨與關(guān)節(jié)疾病的臨床與機理研究。

△通訊作者：孫曉偉(1979-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在站博士后研究人員,研究方向：針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與機理研究。

2017-03-04