彭宇飛，張曉峰，徐西林，馬育軒，王特哈斯，李在斯，王秀珍，，5△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；4.北京理工大學珠海學院，廣東 珠海 519088;5.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院哈南分院，黑龍江 哈爾濱 150000)

實驗研究

中藥關節(jié)腔灌注配合小針刀療法對激素性股骨頭壞死家兔病理組織學變化及TGF-β1表達影響的研究*

彭宇飛1，2，張曉峰1，徐西林3，馬育軒1，王特哈斯1，李在斯4，王秀珍1，3，5△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；4.北京理工大學珠海學院，廣東 珠海 519088;5.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院哈南分院，黑龍江 哈爾濱 150000)

目的：通過建立激素性股骨頭壞死(SANFH)家兔模型，探討活骨注射液髖關節(jié)注射配合針刀療法治療SANFH病程中股骨頭局部病理組織學變化及轉化生長因子(TGF-β1)表達的變化及意義。方法：選擇健康成年雄性新西蘭大白兔72只，采用馬血清加激素法造模。造模成功后，將造模家兔隨機分為模型組、針刀組、灌注組與聯(lián)合組4組,每組18只。模型組與針刀組家兔雙側髖關節(jié)每日給予生理鹽水關節(jié)腔注射，灌注組與聯(lián)合組給予等量活骨注射液雙髖關節(jié)注射治療。各組2、5、8周各處死6只，取雙側股骨頭，HE染色檢測股骨頭病理改變，免疫組化法檢測TGF-β1蛋白表達，RT-PCT法檢測TGF-β1 mRNA表達變化。結果: 聯(lián)合組在SANFH治療的過程中對股骨頭病理組織學及TGF-β1的表達有影響(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。結論:活骨注射液髖關節(jié)注射配合針刀治療SANFH,在治療2周后可使股骨頭病理組織學發(fā)生改變，并促進TGF-β1的表達上調，其中8周達到療效最佳。

針刀療法;活骨注射液；髖關節(jié)腔注射；股骨頭壞死；病理組織學；轉化生長因子

激素性股骨頭壞死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)是由于糖皮質激素大量應用引起的股骨頭缺血、骨細胞大量死亡所導致的骨科常見疾病。隨著醫(yī)療技術的發(fā)展和激素治療更加廣泛的應用，SANFH在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中所占比重居于首位[1]。壞死早期不經有效保頭治療，致殘率極高。在基于前期實驗研究的基礎上[2]，本課題通過活骨注射液關節(jié)腔注射配合針刀治療對SANFH家兔股骨頭病理組織學和轉化生長因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達影響進行研究，以進一步探討中醫(yī)藥治療SANFH的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗儀器：2135型切片機(德國菜卡)，電熱恒溫箱(上海一恒)，醫(yī)用微波爐(上海一恒)，普通PCR儀(美國mj P100)，電子恒溫水浴鍋(北京市永光醫(yī)療儀器廠),熒光定量PCR(美國ABI 7500)，精密天平(瑞士賽多利斯)，小針刀(北京卓越華友)。

實驗試劑：活骨注射液(黑龍江中醫(yī)藥大學制劑室)，多克隆抗兔一抗TGF-β1(北京博奧森),兔二抗PV6001(北京中山金杉生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒[Takara(Japan)]，Realtime PCR試劑盒[Takara(Japan)]，DEPC(Sigma)異丙醇(上海富宇)，氯仿(上海富宇)，無水乙醇(上海富宇)。

1.2 實驗動物及造模方法

選用健康成年雄性新西蘭大白兔72只，體質量(3.0±0.3)kg，哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證書：SYXK(黑)2014002，所有動物單籠飼養(yǎng)，通風，自由飲水，普通喂養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)1周后，精確稱重，參考Matsui等[3]造模方法，各家兔首次經耳緣靜脈注射馬血清8 ml/kg，首次注射之后間隔2周,給予第2次馬血清耳緣靜脈注射。第2次給藥劑量為4 ml/kg。再次間隔2周，以45 mg/kg的給藥劑量連續(xù)3天腹腔注射甲強龍，注射激素期間每只家兔給予青霉素8萬u/只，日2次臀肌注射，預防感染。每日在家兔后肢負重狀態(tài)下驅趕動物2次，造成激素型股骨頭缺血性壞死家兔模型。4周后拍攝家兔髖關節(jié)MRI及股骨頭病理檢查，確定造模效果。

1.3 動物分組及干預

造模成功后，將造模家兔隨機分為模型組、針刀治療組(簡稱針刀組)、活骨注射液灌注治療組(簡稱灌注組)與活骨注射液灌注治療聯(lián)合針刀治療組(簡稱聯(lián)合組)4組,每組18只。根據(jù)人與家兔體表面積折算的等效劑量比值換算，以此得出每只家兔雙髖總給藥量≈1.40 ml。以此劑量給予聯(lián)合組與灌注組活骨注射液關節(jié)腔灌注治療，模型組與針刀組家兔雙側髖關節(jié)每日給予等量生理鹽水關節(jié)腔注射。注射時首先觸及家兔雙側股骨大轉子，以此為體表標志，向后方約0.8～1 cm處為穿刺進針點，向前內側進針1 cm左右可有突破感，推藥時阻力明顯減輕，說明進入關節(jié)囊內，推入藥物。

聯(lián)合組與針刀組針刀治療時，以家兔股骨大轉子后內側0.5 cm處為進針點，此處可捫及一卵圓形凹陷，為股骨頭后緣與股骨頸后方形成的夾角。局麻后取1號針刀垂直刺達骨面，朝向股骨頭方向鉆孔，進入松質骨內前進4 mm即可退出針刀， 可在同一進針點處進行不同角度鉆2～3個孔以減輕壞死區(qū)骨內壓。各組分別于治療后第2、5、8周分批處死動物。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 免疫組化檢測股骨頭組織中TGF-β1蛋白含量及病理組織學改變 組織經常規(guī)石蠟包埋，切片后，經無水酒精、90%、80%、70%酒精、蒸餾水各浸泡5 min，蘇木素染色，酒精中分化，伊紅醇溶液及無水酒精浸泡后，二甲苯兩次浸泡。最后以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察股骨頭病理組織學改變。

從10%甲醛溶液中取出體積約為8 mm×8 mm×5 mm大小的組織。骨組織修塊后，經脫水、透明、浸蠟和包埋后，根據(jù)TGF-β1免疫組化試劑盒說明，對TGF-β1進行檢測。應用Image-pro plus6.0計算免疫組化圖片IOD值，應用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。應用HE染色法，顯微鏡下觀察TGFβ1蛋白表達。

1.4.2 采用PT-PCR法檢測TGF-Β1 mRNA表達 取100 mg股骨頭組織加入Trizol1ml以提取總RNA，逆轉錄所用引物序列見表1。逆轉錄按照: 預變性、變性、退火、延伸、重復變性、退火、再延展進行循環(huán)，共進行35個循環(huán)，充分延伸。擴增產物在瓊脂糖凝膠中進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)計算TGF-β1、GAPDH的mRNA相對含量。GSR計算方法為TGF-β1的平均密度×面積/GAPDH的平均密度×面積。

2 結果

2.1 HE染色檢測股骨頭病理組織學變化

2.1.1 病理觀察 見圖1。聯(lián)合組：骨膜完整光滑，骨皮質質地均勻，軟骨細胞排列整齊，骨小梁致密，軟骨厚度正常、骨細胞排列整齊均勻，形態(tài)正常，軟骨下血管較多，空骨陷窩形態(tài)規(guī)則，分布均勻，股骨頭內骨質均勻，骨髓腔內有大量造血細胞，脂肪細胞分布均勻，血管較多。

圖1 HE染色100倍鏡下觀察

灌注組：骨膜較完整光滑，有光澤，骨皮質質地較均勻，軟骨細胞有增生，骨小梁厚度變薄，其間填充脂肪較少，形成網(wǎng)狀，周圍可見大量成骨細胞、新生血管較多，內皮細胞增生，骨陷窩較少，骨髓內有較多造血細胞，脂肪細胞形態(tài)基本正常，分布均勻。

針刀組：骨膜較完整，欠光滑，軟骨表面略暗，骨皮質質地較均勻，軟骨細胞有增生，骨小梁厚度變薄，部分填充脂肪，形成網(wǎng)狀，周圍可見較多成骨細胞、新生血管存在，內皮細胞增生，骨陷窩較灌注組多，骨髓內有較多造血細胞，脂肪細胞形態(tài)基本正常，分布均勻

模型組：骨膜不完整，軟骨表面無光澤，軟骨厚度明顯變薄，厚薄不均勻，骨皮質變薄，厚度不均勻，骨小梁數(shù)量減少，變細疏松，并有斷裂，骨細胞減少，軟骨下血管減少，空骨陷窩形態(tài)不規(guī)則，骨髓腔相對增大，造血細胞數(shù)量減少網(wǎng)狀結構稀疏，脂肪細胞體積增大，8周時增大較明顯，血管減少。

2.1.2 空骨陷窩 骨細胞位于骨陷窩內，隨著時間的推移，聯(lián)合組骨陷窩明顯減少，灌注組空骨陷窩呈下降趨勢，針刀組和模型組的骨陷窩均呈增加的趨勢，在8周時針刀組與模型組的空骨陷窩數(shù)最多，達到高峰。在相同時間點，模型組的空骨陷窩多于其他各組。聯(lián)合組與灌注組、針刀組及模型組空骨陷窩數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 RT-PCR檢測股骨頭區(qū)TGF-β1 mRNA表達情況的對比結果

結果顯示：活骨注射液關節(jié)腔灌注及針刀治療均能夠顯著提高SANFH兔股骨頭組織中TGF-β1 mRNA的表達。聯(lián)合組中表達量較其余各組差異極顯著(P<0.01)。模型組2周及5周時表達量較聯(lián)合組有較快上升(P<0.05)，但5～8周其上升趨勢明顯變緩。與模型組相比較，針刀組各時間點TGF-β1 mRNA表達始終明顯較高(P<0.01),但于5周、8周上升趨勢變緩。灌注組2周時與針刀組比較即有較高的表達(P<0.05),5周及8周時與針刀組比較，表達有極顯著差異(P<0.01)。見表1、表3和圖2。

表1 RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA表達及引物設計

圖2 Realtime-PCR檢測TGF-β1 mRNA

組別n2周5周8周聯(lián)合組614.00±2.831)12.80±1.831)10.67±4.631)灌注組621.78±2.541)2)20.67±2.451)2)18.67±2.451)2)針刀組621.31±2.451)2)24.67±2.451)2)31.78±2.541)2)模型組623.89±5.752)31.39±5.752)44.11±4.592)

注：與模型組比較，1)P<0.05;與聯(lián)合組比較，2)P<0.05

表3 各組RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA擴增結果比較

注：與模型組比較，1)P<0.05;與聯(lián)合組比較，2)P<0.05;與針刀組比較，3)P<0.05

2.3 免疫組化檢測TGF-β1結果

表4 各組兔不同時間點TGF-β1蛋白表達比較(IOD值

注：與模型組比較，1)P<0.05;與聯(lián)合組比較，2)P<0.05

結果顯示：活骨注射液關節(jié)腔灌注及針刀治療均能夠顯著提高SANFH兔股骨頭組織中TGF-β1的蛋白表達。聯(lián)合組中TGF-β1表達量較其余各組差異顯著(P<0.05)。與模型組相比較，針刀組各時間點TGF-β1蛋白表達始終明顯較高(P<0.01),但于5周、8周上升趨勢變緩。灌注組2周時與模型組比較即有較高的表達(P<0.05)。5周及8周時與針刀組比較，TGF-β1表達有極顯著差異(P<0.01)。見表4和圖3。

圖3 TGF-β1免疫組化結果

3 討論

活骨注射液是以丹參、川芎、骨碎補3味藥提純取得的中藥制劑，具有活血行氣、補腎強骨之功。既往研究發(fā)現(xiàn)，活骨注射液關節(jié)腔灌注對于ANFH具有很好的療效。本課題的創(chuàng)新之處在于活骨注射液的給藥方式創(chuàng)新性的采用中藥關節(jié)腔灌注，藥物直接達到病變部位，有利于發(fā)揮藥物的治療作用,腔內直接作用于支配股骨頭的主要血管，使血管擴展，降低血液黏度；同時直接作用于滑膜，使滑膜的血液循環(huán)得到改善；再者，關節(jié)腔給藥后關節(jié)腔內壓力增髙，關節(jié)液產生壓差，促進關節(jié)軟骨對關節(jié)液的吸收作用，有助于藥物通過軟骨板向股骨頭內滲透，直接作用于股骨頭內的壞死區(qū)，促進新骨的生長。

TGF-β1是一種具有多種功能的多肽生長因子，可促進成骨細胞增殖與分化，也可促進骨膠原產生。TGF-β1作為參與體內生理生化、信號轉導與調控的重要因子，可在調控未分化間充質干細胞增殖分化的同時，促進成骨細胞增殖、骨與血管形成。TGF-β1還具有支持破骨細胞形成、刺激骨吸收的雙重作用，是骨形成和骨吸收之間重要的耦聯(lián)調節(jié)因子，在股骨頭壞死區(qū)修復重建的過程中，起到不可或缺的重要作用。

隨著MSCs移植技術的不斷提高，它已成為細胞移植治療SANFH的理想種子，但在股骨頭缺血壞死的病理條件下，壞死區(qū)血液循環(huán)受到嚴重破壞，MSCs在缺氧環(huán)境下大量凋亡，阻礙成骨過程。如果提高MSCs的抗凋亡能力，是股骨頭缺血性壞死修復重建的重要突破。有學者研究[4-5]TGF-β1對MSCs在無氧無血清條件下凋亡的影響，結果顯示：用TGF-β1預處理MSCs后，通過上調bcl-2mRNA水平抑制無氧無血清誘導的細胞凋亡。已有研究[6-7]顯示活血、補腎的中藥可刺激成骨細胞TGF―β1mRNA的分泌與合成。本實驗結果顯示，在股骨頭壞死病理狀態(tài)下，機體早期通過自身修復機制使TGF-β1表達上升，以促進壞死區(qū)成骨分化及破骨吸收，但隨著時間的延長，模型組5～8周時TGF-β1的蛋白及mRNA表達并不再升高。提示這種機體自身修復作用是有限且受到抑制的，這可能與股骨頭壞死區(qū)缺血缺氧、骨內壓增高等不利于股骨頭修復的因素直接相關。針刀組與灌注組TGF-β1的表達呈持續(xù)增高趨勢，但灌注組TGF-β1表達始終高于針刀組(P<0.05)，提示針刀治療及中藥關節(jié)灌注治療均能對股骨頭壞死區(qū)起到修復作用。聯(lián)合組TGF-β1表達明顯高于其他各組(P<0.01),提示針刀聯(lián)合關節(jié)腔灌注治療能夠有效促進股骨頭壞死區(qū)新骨形成及破骨吸收過程，從而促進壞死區(qū)修復。

針刀療法是結合了中醫(yī)的針灸與西醫(yī)手術刀兩者優(yōu)點于一身的一種治療方法，在治療ANFH時多有應用。陳關富等[8]應用針刀治療缺血性股骨頭壞死1162例，總有效率91.4%。瞿群威等[9]通過對60例FicatⅠ～Ⅱ期和Ⅲ期前期ANFH患者隨機分為3組，研究針刀療法對髖關節(jié)腔減壓、骨髓腔減壓和髖關節(jié)周圍軟組織松解的整體松解治療對髖關節(jié)功能改善的影響，結果顯示針刀整體松解治療效果優(yōu)于單純松解關節(jié)腔或骨髓腔減壓治療。王占有等[10]將60例早、中期股骨頭壞死患者隨機分為治療組與對照組，比較針刀治療與髓芯減壓治療療效，結果顯示二者對ONFH均有治療作用，但針刀治療效果優(yōu)于單純髓芯減壓效果(P<0.05)。針刀療法不僅通過鉆孔及切割作用起到降低骨內壓及關節(jié)囊內壓、促進動脈血液灌注及靜脈血回流作用，更具備針灸的疏通經絡、調節(jié)臟腑功能的作用，利于其內含的健康成骨細胞促進壞死區(qū)修復，激發(fā)機體自身修復功能。

本實驗通過活骨注射液灌注配合針刀治療，既能夠提高TGF-β1表達，促進成骨分化以促進股骨頭骨質修復，而TGF-β1又能在內環(huán)境刺激下提高VEGF表達，促進新血管生成。聯(lián)合組又給予針刀減壓松解，更加有利于機體修復機制發(fā)揮作用，使TGF-β1表達進一步升高,從而延長了修復作用的時間，使壞死區(qū)成骨與破骨作用相平衡，從而促進壞死區(qū)骨質的修復。

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HistopathologicalChangesandExpressionofTGF-β1inSANFHRabbitsundertheTreatmentofIntra-articularInjectionofChineseMedicineCombinedwithAcupotomy

PENG Yu-fei1,2, ZHANG Xiao-feng1, XU Xi-lin3, MA Yu-xuan1, WANG Te-hasi1, LI Zai-si4, WANG Xiu-zhen1,3,5△

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China;4.ZhuhaiCollegeofBeijingInstituteofTechnology,Zhuhai519088,China;5.HananBranch,theSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150000,China)

Objective：To explore the changes of local histopathology and TGF-β1 in SANFH rabbits with Huogu injection combined with acupotomy.Methods72 healthy New Zealand white rabbits were modeled with horse serum and hormone. After successful modeling, they were randomly divided into the model group(n=18), the acupotomy group(n=18), the injection group(n=18), and the combination group (n=18). The rabbits in the model group and the acupotomy group were treated with saline injection into both hip joints. The injection group and the combination group were given the same amount of Huogu injection into both hip joints. Six rabbits were killed to take out the bilateral femoral heads each time at week 2, week 5, and week 8, HE staining was used to detect the pathological changes of the femoral heads. The expression of TGF-β1 protein was detected by immunohistochemistry. The expression of TGF-β1 mRNA was detected by RT-PCT.ResultsThe combination group had a significant effect on the histopathology and the expression of TGF-β1 in the process of SANFH (P<0.05).ConclusionThe treatment of Huogu injection into hip joint combined with acupotomy therapy can improve the histopathology of the femoral heads and promote the up-regulation of TGF-β1 in the treatment of SANFH after two weeks of modeling, and the best effect happened after eight weeks.

Acupotomy therapy; Huogu injection; Hip joint injection; Femoral head necrosis; Histopathology; Transforming growth factor

R246.2

A

1005-0779(2017)09-0047-05

黑龍江省自然科學基金面上項目,編號：H201467;黑龍江省博士后科研基金項目，編號：LBH-Z16194。

彭宇飛(1984-)，男，住院醫(yī)師，2014級中醫(yī)骨傷科學專業(yè)博士研究生，研究方向：骨壞死的中醫(yī)治療。

△通訊作者：王秀珍(1987-)，女，住院醫(yī)師，黑龍江中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合博士后科研流動站在站工作人員,研究方向：針藥結合治療內科疑難雜癥。

2017-03-02