嚴 恒， 劉靜靜， 沈正雨， 張 瑞， 胡瑩瑩， 謝衛(wèi)紅*

(1.湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢 430073; 2.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068)

人工合成色素由于其低成本、高穩(wěn)定性及染色效果較強的特性，已被廣泛用作食品工業(yè)中的添加劑。然而，人工合成色素的安全性較低，過量的食用會對人體造成傷害，因此我國對食品著色劑有明確的使用標準和限量[1 - 3]。赤蘚紅屬于雜氧蒽類人工合成色素，主要用于果蔬、肉類、調料、糕點、飲料等的著色，其允許添加范圍為0.015～0.1 g/kg[4 - 5]。為了保證食品的安全性，嚴格控制人工合成色素的使用量，精確的色素檢測方法是不可或缺的。但是，食品基質成分比較復雜，給準確檢測帶來一定困難，因此，在色素檢測前有效地樣品前處理及富集過程是非常必要的[6 - 8]。赤蘚紅在幾種常用的食品著色劑中屬于較特殊的一種，對于含有赤蘚紅食品的前處理方法常用的有兩種：一種是國家標準規(guī)定的液-液萃取，另一種是固相萃取(如聚酰胺粉固相萃取小柱)。然而，這兩種方法都存在一定的弊端，液-液萃取消耗的試劑較大，步驟較繁瑣；聚酰胺粉固相萃取吸附材料對于色素的提取依靠的是非特異性作用力，對目標物質的提取缺乏選擇性，導致基質中的其它組分同時被萃取出來，影響了對食品中赤蘚紅的分離富集。因此，需要探究一種新的材料用于赤蘚紅的選擇性分離和富集[9 - 11]。

分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)是一種仿抗體材料，能夠將目標物質從復雜的樣品中選擇性吸附出來，已被廣泛開發(fā)應用于各個領域，包括固相萃取、傳感器、酶抑制劑和抗體等[12 - 15]。近年來，許多MIP利用其本身的特性用于其它人工合成色素的檢測，并取得了良好的結果[16 - 17]。但是，MIP用于赤蘚紅的檢測文獻報道很少。本文采用表面印跡方法，制備核-殼型赤蘚紅MIP，將其作為吸附材料，利用其高親和力和選擇性能夠將赤蘚紅從復雜的食品基質中提取出來，提高了回收率。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

UV-Lambda 35紫外-可見分光光度計(美國，鉑金艾爾默公司)；Nicolet 5700傅里葉紅外掃描儀(美國，Nicolet公司)；Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國，賽默飛世爾科技公司)。

二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、赤蘚紅(Erythrosine)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(分析純)；4-乙烯基吡啶(4-VP)和聚酰胺粉(Polyamide)購于國藥集團化學試劑有限公司(分析純)；偶氮二異丁腈(AIBN純度98%)，購于上海源葉生物科技有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，純度98%)購于Sigma-Aldrich貿易有限公司。水為超純水。

1.2 實驗步驟

1.2.1SiO2表面氨基化將10 g SiO2用0.25 mol/L NaOH溶液在室溫下攪拌蝕刻30 min，過濾，超純水洗滌，再加入2 mol/L的HCl 90 ℃回流8 h，過濾，超純水洗脫至中性，干燥。將處理好的SiO2顆粒分散在5%(V/V)的APTES甲苯溶液中，90 ℃回流12 h，結束后用甲醇除去未反應的APTES，干燥得到表面氨基化修飾的SiO2顆粒。

1.2.2SiO2表面赤蘚紅分子印跡層的制備在50 mL甲醇∶水=4∶1(V/V)中，加入0.95 mmol功能單體4-VP和0.24 mmol赤蘚紅，室溫下攪拌孵育2 h，然后依次加入1 g氨基化SiO2、4.75 mmol交聯劑EGDMA、0.014 g引發(fā)劑AIBN，超聲混勻，通氮氣除氧，70 ℃反應24 h。反應結束后聚合物用含10%氨水的甲醇進行洗脫(索氏提取)，最后再用甲醇洗脫，直至用紫外-可見分析法檢測不到模板分子為止。非分子印跡聚合物(Non-imprinted Polymer,NIP)的制備除不加模板外，其它制備過程與MIP一樣。

1.2.3動力學吸附實驗稱取10 mg MIP和NIP各5份于4 mL的離心管內，每個離心管內加入1 mL濃度為600 μg/mL赤蘚紅水溶液，超聲混勻后靜置吸附。分別在第5、15、30、45、60 min時用紫外-可見分光光度法測其在533 nm處的吸光值，觀察其吸附容量隨吸附時間的變化規(guī)律。

(1)

其中，Q為吸附容量(μg/mg)；c0為吸附前赤蘚紅溶液的濃度(μg/mL)；c為吸附后赤蘚紅溶液的濃度(μg/mL)；V為吸附液體積(mL)；m為聚合物的質量(mg)。

1.2.4等溫吸附實驗分別稱取若干份10 mg赤蘚紅分子印跡聚合物和非印跡聚合物于4 mL的離心管內，加入不同濃度的赤蘚紅水溶液，超聲混勻后室溫下靜置吸附。吸附完成后，離心、取上清液，用紫外-可見分光光度儀測定溶液中未被吸附的赤蘚紅在533 nm處的吸光值。根據吸光值的變化算出赤蘚紅吸附前后濃度的變化進而得出聚合物的吸附容量。

1.2.5加標回收實驗選取“農夫果園果汁”飲料作為實驗對象，赤蘚紅的加標濃度為1、5、10 μg/mL。分別準確稱取20 mg MIP和聚酰胺粉各3份于4 mL的離心管內，然后加入2 mL不同濃度的赤蘚紅果汁溶液，使三份離心管中果汁的色素添加量分別為2、10、20 μg。室溫靜置吸附20 min后，離心、去除上清。每個離心管內加入2 mL的淋洗液(V水∶V甲酸∶V甲醇=4∶2∶4)，超聲洗脫，離心、去除上清；再用10%的氨化甲醇溶液洗脫吸附在MIP和聚酰胺粉上的色素，洗脫液經0.22 μm濾膜過濾后，蒸發(fā)至近干，加甲醇復溶，進行高效液相色譜( HPLC)分析。另一種處理方法是MIP和聚酰胺粉吸附色素后，中間省去淋洗步驟，直接用10%的氨化甲醇溶液進行洗脫所吸附的色素，然后進行HPLC分析。

液相色譜條件：Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-乙酸銨溶液(pH=4，0.02 mol/L)；梯度洗脫:甲醇：20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%繼續(xù)6 min；流速:1 mL/min；紫外檢測器檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 核-殼型赤蘚紅分子印跡聚合物的制備及紅外表征

2.1.1核-殼型分子印跡聚合物制備為了便于離心分離以及后續(xù)固相萃取柱的開發(fā)利用，我們將赤蘚紅的分子印跡聚合物制備在柱層析常用的SiO2柱表面，經過活化的SiO2表面首先硅烷化修飾使SiO2表面帶有氨基基團以利于模板分子在SiO2表面的吸附。通過條件優(yōu)化，分子印跡聚合物層的制備采用4-VP作為功能單體，模板與功能單體的摩爾數比為1∶4，模板的洗脫液以10%氨水的甲醇效果最好。MIP層的制備及重吸附見圖1。

圖1 核-殼型赤蘚紅分子印跡聚合物制備路線Fig.1 Synthesis route of core-shell erythrosine molecularly imprinted polymer

圖2 NIP(a)、氨基化SiO2(b)和SiO2(c)的紅外(IR)光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NIP(a),aminated SiO2(b) and SiO2(c)

2.1.2分子印跡聚合物紅外表征圖2為SiO2、氨基化SiO2及NIP的紅外光譜圖。對比未氨基化修飾的SiO2，在圖中可以看出氨基化SiO2在2 900 cm-1處有C-H鍵和685 cm-1處有Si-C鍵的伸縮振動吸收峰，說明硅烷化氨基修飾上去了。對比氨基化SiO2和NIP的紅外圖譜，發(fā)現NIP在1 700 cm-1左右處有交聯劑中C=O伸縮振動吸收峰，而氨基化SiO2沒有，說明通過聚合反應可以在氨基化SiO2外面包裹了一層聚合物。

2.2 動力學吸附實驗

動力學實驗的結果如圖3所示。由圖可知，MIP和NIP在0～15 min時，其吸附容量隨著吸附時間的延長迅速增加，當其大于15 min時，吸附曲線趨于平緩，說明在15 min時MIP和NIP達到吸附平衡。NIP的吸附容量小于MIP，這是由于分子印跡聚合物表面的特異性結合位點對靶標物質的特異性識別所產生的。

2.3 等溫吸附實驗

等溫吸附實驗的結果如圖4所示。由圖可知，當赤蘚紅濃度小于800 μg/mL時，MIP對赤蘚紅的吸附隨赤蘚紅濃度的增加而增大，當赤蘚紅濃度大于800 μg/mL時，吸附容量沒有太大的變化，則此時吸附趨于飽和。而NIP的等溫吸附趨勢與MIP相似，但吸附容量小于MIP，這主要是由于印跡聚合物對模板分子的特異性吸附。

圖3 MIP和NIP吸附赤蘚紅的動力學吸附曲線Fig.3 Kinetic adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine Erythrosine aqueous solution:600 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm,room temperature.

圖4 MIP和NIP對赤蘚紅的等溫吸附曲線Fig.4 Isothermal adsorption curves of MIP and NIP for erythrosine The concentration of erythrosine range from 50 μg/mL to 1 400 μg/mL,UV-Vis absorption was detected at λ=533 nm after 20 min’s adsorption at room temperature.

為了進一步分析印跡聚合物微球對模板分子的結合能力，將Langmuir-Freundlich(LF)模型用于評價分子印跡聚合物的結合特性。其方程式為：

(2)

式中，Q為聚合物微球對于模板分子的平衡吸附容量(μg/mg)，ce為平衡吸附時溶液中游離的模板濃度(μg/mL)，KLF表示結合常數(mL/μg)，Qm為最大表觀吸附容量(μg/mg)，n代表結合位點的異質性系數。

Langmuir-Freundlich(LF)等溫線無論是對于均質的MIP，還是對于非均質的MIP都有著較為理想的近似擬合效果，從而可以用來比較具有不同分布位點的MIP的結合特性。通過模擬，得出的Qm為48.02 μg/mg，KLF為0.048 mL/μg，n為1.81，R2=0.994。

2.4 加標回收實驗

圖5為赤蘚紅加標果汁經MIP和聚酰胺粉提取后的HPLC圖，表1和表2分別為經過淋洗和不經過淋洗過程聚酰胺粉和MIP對添加到果汁中赤蘚紅的回收率。由表1和表2可知，MIP和聚酰胺粉對添加到果汁中低濃度的赤蘚紅都有一定的吸附，對比實驗過程中是否含有淋洗步驟，發(fā)現未經過淋洗步驟的MIP回收率高于含有淋洗步驟的回收率，且MIP的回收率較高于聚酰胺粉，在85%以上。以上這些結果表明赤蘚紅分子印跡聚合物可以用于食品樣品中赤蘚紅的選擇性吸附分離，且過程中不需要淋洗步驟，節(jié)約了大量的有機溶劑，可以作為一種潛在的固相萃取吸附材料。

圖5 淋洗(A、B、C)和非淋洗(D、E、F)條件下赤蘚紅加標果汁經MIP和聚酰胺粉提取后的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatograms of erythrosine spiked juice was extracted by MIP and polyamide under the condition of leaching(A,B,C) and non-leaching(D,E,F) a:erythrosine standard;b:the spiked juice is extracted by MIP;c:the spiked juice is extracted by polyamide.spiked level:2 μg(A,D),10 μg(B,E),20 μg(C,F).peak 1:erythrosine. 表1 有淋洗處理過程的赤蘚紅的回收率和精確度Table 1 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice with leaching condition

AdsorbentSpiked(μg)Found(μg)Recovery(%)RSD(%)Polyamide2010.5152.5516.44105.0950.9014.7221.0251.002.65MIP208.5142.5522.39103.7537.5029.2120.8241.001.68

表2 無淋洗處理過程的赤蘚紅的回收率和精確度Table 2 Recovery and precision of erythrosine in the spiked juice without leaching condition

3 結論

采用表面分子印跡技術，以氨基改性的SiO2為內核，赤蘚紅為模板，4-乙烯基吡啶為功能單體，成功制備了核-殼型色素分子印跡聚合物。該印跡聚合物具有較快的吸附能力，有較好的吸附能力。在實際樣品加標實驗中，對比聚酰胺粉結果，其回收率較好，且過程中不需要淋洗步驟節(jié)約了大量的有機溶劑，可以作為一種潛在的固相萃取吸附材料。