宋瑾,王超,陽(yáng)仁達(dá),馮果,譚成富,劉薇薇,嚴(yán)潔

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208)

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠NO、NOS及線(xiàn)粒體膜電位的影響

宋瑾,王超,陽(yáng)仁達(dá),馮果,譚成富,劉薇薇,嚴(yán)潔

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208)

目的通過(guò)測(cè)定心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及線(xiàn)粒體膜電位,探討電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠NO、NOS及線(xiàn)粒體膜電位的影響。方法將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(模型組)、電針內(nèi)關(guān)穴組和電針環(huán)跳穴組,每組10只。采用冠脈結(jié)扎法造模,電針內(nèi)關(guān)組和電針環(huán)跳組在造模前,分別給予電針刺激20 min/d,共7 d。記錄造模前后心電圖Ⅱ?qū)?lián)T波電壓值,HE染色檢測(cè)心肌病理形態(tài)學(xué)的變化,采用硝酸還原酶化學(xué)比色法檢測(cè)血清NO、NOS的含量,熒光技術(shù)法測(cè)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的變化。結(jié)果模型組血清NO、NOS含量及線(xiàn)粒體膜電位較假手術(shù)組明顯下降(P＜0.01,P＜0.05);電針內(nèi)關(guān)穴組血清NO、NOS含量較模型組、假手術(shù)組和電針環(huán)跳組明顯升高(P＜0.01,P＜0.05);電針內(nèi)關(guān)穴組線(xiàn)粒體膜電位較模型組、電針環(huán)跳穴組和假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05);模型組與電針環(huán)跳穴組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠具有預(yù)保護(hù)作用,可以通過(guò)提高NO含量、增強(qiáng)NOS活性,減少心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降,抑制細(xì)胞凋亡,從而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

心肌再灌注損傷;電針;穴,內(nèi)關(guān);一氧化氮合酶;線(xiàn)粒體膜電位;大鼠

近年來(lái),隨著冠心病的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡逐漸年輕化,有的發(fā)病年齡甚至不到30歲,因此,掌握冠心病的預(yù)防及治療方面的基本常識(shí)顯得尤為重要,本課題組經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究證明電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血有明顯的改善作用[1-5]。一氧化氮(NO)是機(jī)體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子,為神經(jīng)傳遞、血管舒張、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能的內(nèi)源性介質(zhì),與神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程關(guān)系密切[6-8],而一氧化氮合酶(NOS)是 NO生物合成的限速酶。線(xiàn)粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器,且可能是引發(fā)衰老和疾病的基礎(chǔ)原因。而兩者密切相關(guān)的關(guān)鍵點(diǎn)就是線(xiàn)粒體膜電位,線(xiàn)粒體膜電位是維持線(xiàn)粒體功能和結(jié)構(gòu)的根本,它的改變將會(huì)造成線(xiàn)粒體膜發(fā)生一系列的功能和狀態(tài)的變化,線(xiàn)粒體膜電位的喪失被認(rèn)為是心肌細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)顯著的特征。內(nèi)關(guān)穴為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴,又為八脈交會(huì)穴之一,通于陰維脈,主治心痛、胸悶、心煩等心臟疾病及經(jīng)脈循行部位的其他疾病[9-11]。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)觀察電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血后再灌注損傷與內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)NO、NOS及心肌線(xiàn)粒體膜電位的關(guān)系,為針刺內(nèi)關(guān)穴防治心血管疾病及經(jīng)穴臟腑理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)雄性SD大鼠,250～300 g,共40只,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK湘 2013-0005,SCXK湘2013-0004)。隨機(jī)分為4組,假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、針刺內(nèi)關(guān)穴組、針刺環(huán)跳穴組,每組10只。

1.2 主要試劑與設(shè)備

細(xì)胞凋亡線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);免疫組化檢測(cè)腺苷A1受體試劑盒,腺苷A1受體抗體規(guī)格1 mL(美國(guó)Santacruz公司),圖像分析軟件為 IPP(Image-Pro-Plus),顯微鏡(MOTIC BA210T);華佗牌 SDZ-Ⅴ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司);漢醫(yī)牌一次性使用無(wú)菌針灸針(0.25 mm×13 mm,100支/盒)(長(zhǎng)春愛(ài)泉醫(yī)療器械有限公司);醫(yī)用離心機(jī)臺(tái)式高速離心機(jī) H1850動(dòng)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);數(shù)字式心電圖機(jī) ECG-1106G(深圳市凱沃爾電子有限公司);動(dòng)物呼吸肌 ALC-V108(上海奧爾科特生物科技有限公司);流式細(xì)胞儀(南京建成生物工程研究所)。

1.3 造模方法

造模參照汪謙[12]的方法,大鼠 250～300 g以10%水合氯醛麻醉0.3 mL/100 g腹腔注射。行氣管插管后,接動(dòng)物人工呼吸機(jī)(頻率 70～80次/min,潮氣量 5～6 mL/100 g),然后沿左側(cè)第4、5肋骨間開(kāi)胸,輕輕剪破心包膜,提起左心耳,在冠狀動(dòng)脈左前降支1/3處穿4“0”號(hào)線(xiàn),置一硅膠管結(jié)扎,以心電圖ST段的改變及冠脈向外膨脹發(fā)紺為結(jié)扎成功標(biāo)志,結(jié)扎 40 min后,剪開(kāi)/取下硅膠管恢復(fù)左前降支灌流60 min,腹主動(dòng)脈取血3～5 mL,摘取心臟。

1.4 穴位定位及處理方法

1.4.1 穴位定位

內(nèi)關(guān)、環(huán)跳定位參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》并結(jié)合解剖學(xué)定位。內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè),離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。環(huán)跳穴位于股骨大轉(zhuǎn)子后上緣凹陷處。

1.4.2 處理方法

參照汪謙[12]的方法,假手術(shù)組和模型組飼養(yǎng)至第7天,其中假手術(shù)組開(kāi)胸,左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿線(xiàn)不結(jié)扎,40 min后,再灌注60 min后,記錄心電圖,模型組左冠狀動(dòng)脈前降支上、中1/3交界處穿線(xiàn)結(jié)扎,40 min后,再灌注60 min后,記錄心電圖。電針內(nèi)關(guān)穴組和電針環(huán)跳穴組在進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷造模之前 7 d,每天給予電針刺激,分別針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴和環(huán)跳并連接 SDZ-V型電子針療儀(10 Hz,疏密波),時(shí)間20 min,每日1次,共針刺7次后再行造模。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 心電圖Ⅱ?qū)?lián)T波

分別打印各組大鼠術(shù)前、結(jié)扎后 1 min、結(jié)扎后40 min、再灌注后60 min心電圖圖紙,選?、?qū)?lián)T波電壓作為觀察指標(biāo),量取每只大鼠連續(xù)10個(gè)心動(dòng)區(qū)間的T波電壓值,并計(jì)算出10個(gè)心動(dòng)區(qū)間T波的平均值。

1.5.2 光鏡及電鏡觀察大鼠左心室缺血心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

1.5.2.1 標(biāo)本采集

各組大鼠分別在造模結(jié)束后取材,用眼科小剪刀取下左冠狀動(dòng)脈前降支穿線(xiàn)(假手術(shù)組)或結(jié)扎(模型組、電針內(nèi)關(guān)組及電針環(huán)跳組)下段左心室心肌組織,將剪取的心肌組織迅速以冰冷的生理鹽水洗凈,并分成兩份,將其中一份心肌組織迅速修成 5 mm×1 mm×1 mm組織塊(約距心尖3～5 mm區(qū)域)后浸入2.5%戊二醛固定 24 h(4℃)用于觀察左心室缺血區(qū)組織超微結(jié)構(gòu);另一份心肌組織迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醇固定液中固定,用于HE染色及免疫組化檢測(cè)。

1.5.2.2 HE染色觀察左心室缺血區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)的變化

石蠟切片厚度5 μm,裱于干凈載玻片上,60℃烘箱中烤片4 h,而后二甲苯脫蠟兩次,每次15 min→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→蒸餾水蘇木素染胞核 10 min→10%鹽酸乙醇分化→自來(lái)水沖15 min(反藍(lán))→蒸餾水Ⅰ→蒸餾水Ⅱ→伊紅染胞漿→各級(jí)乙醇脫水→二甲笨透明→樹(shù)脂膠封片→光鏡下觀察心肌細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化,照相。

1.5.3 JC-1染色法測(cè)線(xiàn)粒體膜電位

取500 μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮,37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育 15～20 min;室溫離心(200 rpm,5 min)收集心肌細(xì)胞,用 500 μL 1×染色結(jié)合液洗兩次;吸取500 μL 1×染色結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.5.4 硝酸還原酶化學(xué)比色法測(cè)NO、NOS

按NO、NOS試劑盒檢測(cè)步驟,用754紫外分光光度計(jì)測(cè)定NO、NOS活性;以硝酸還原酶比色法測(cè)定其組織蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),滿(mǎn)足正態(tài)性時(shí),采用單因素方差分析。組間比較若方差齊時(shí)采用LSD法檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠心電圖T波的影響

各組大鼠術(shù)前T波電壓比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說(shuō)明各組大鼠術(shù)前齊同可比。造模后各時(shí)段模型組、電針內(nèi)關(guān)組、電針環(huán)跳組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05),表明造模成功。結(jié)扎后40 min與再灌注60 min,與模型組比較,電針內(nèi)關(guān)組T波均明顯下降(P＜0.01),而電針環(huán)跳組與模型組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05),與電針內(nèi)關(guān)組比較,電針環(huán)跳組T波均明顯升高(P＜0.01)。以上結(jié)果提示,電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理能改善心肌缺血再灌注大鼠心電圖T波。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)扎后T波的比較 (±s)

表1 各組大鼠結(jié)扎后T波的比較 (±s)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型組比較3)P＜0.01;與電針內(nèi)關(guān)組比較4)P＜0.01

組別 n 結(jié)扎前 結(jié)扎后1 m i n 結(jié)扎后4 0 m i n 結(jié)扎后6 0 m i n假手術(shù)組 1 0 0.2 0 3±0.0 2 1 0.2 8 4±0.0 3 3模型組 1 0 0.2 0 8±0.0 2 4 0.4 1 9±0.0 4 41)電針內(nèi)關(guān)組 1 0 0.2 0 7±0.0 2 2 0.3 8 8±0.0 4 31)電針環(huán)跳組 1 0 0.2 0 9±0.0 1 7 0.4 1 8±0.0 4 11)0.2 8 2±0.0 2 3 0.2 7 7±0.0 2 3 0.6 3 8±0.0 4 01) 0.4 1 6±0.0 4 21)0.4 9 4±0.0 3 91)3) 0.3 6 2±0.0 4 92)3)0.6 0 8±0.0 6 61)4) 0.4 1 1±0.0 4 61)4)

2.2 電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠心肌組織病理學(xué)改變的影響

假手術(shù)組心肌組織無(wú)明顯病理變化,心肌細(xì)胞排列整齊,胞核形態(tài)正常,胞質(zhì)無(wú)嗜酸性變。模型組心肌細(xì)胞嚴(yán)重紊亂、斷裂,胞核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。電針內(nèi)關(guān)穴組心肌細(xì)胞紊亂、斷裂程度較輕,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯減少,無(wú)明顯充血、水腫。電針環(huán)跳組心肌細(xì)胞紊亂、斷裂,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,有明顯充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變(×400)

2.3 電針內(nèi)關(guān)對(duì)MlRl 大鼠NO、NOS含量的影響

模型組血清NO、NOS的含量與假手術(shù)組相比明顯下降(P＜O.01,P＜0.05);電針內(nèi)關(guān)穴組血清 NO、NOS含量較模型組明顯升高(P＜0.01);電針內(nèi)關(guān)穴組血清NO、NOS含量較假手術(shù)組和電針環(huán)跳組明顯升高(P＜O.01,P＜0.05);而電針環(huán)跳穴組與模型組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。以上結(jié)果提示,電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以使心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中 NO的含量升高,NOS的活性增強(qiáng)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清NO、NOS含量的比較 (±s,μmol/L)

表2 各組大鼠血清NO、NOS含量的比較 (±s,μmol/L)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜O.05,2)P＜O.01;與模型組比較3)P＜0.01;與電針環(huán)跳組比較4)P＜0.05,5)P＜0.01

組別 n NO NOS假手術(shù)組 10 45.00±8.01 35.44±2.14模型組 10 30.52±6.241) 32.24±3.182)電針內(nèi)關(guān)組 10 51.75±7.183)4) 37.80±1.943)5)電針環(huán)跳組 10 38.94±14.75 34.20±3.74

2.4 電針內(nèi)關(guān)對(duì)MlRl大鼠線(xiàn)粒體膜電位的影響

當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí) JC-1聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒光;在線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí),形成單體,產(chǎn)生綠色熒光,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況,綠色熒光通過(guò) FITC通道通常為FL1來(lái)檢測(cè),紅色熒光通過(guò)PI通道通常為FL2來(lái)檢測(cè)。正常細(xì)胞(FL-1亮,FL-2亮;R1),凋亡細(xì)胞(FL-1亮,FL-2暗;R2),流失檢驗(yàn)結(jié)果如圖2。R1(右上限)代表正常細(xì)胞,R2(右下限)代表凋亡細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的顯綠色熒光的細(xì)胞數(shù)(凋亡細(xì)胞)可間接反映細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的大小,凋亡細(xì)胞值越大,線(xiàn)粒體膜電位就越低。各組大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的比較 (±s,%)

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的比較 (±s,%)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜O.01;與模型組比較2)P＜0.05;與電針環(huán)跳穴組比較3)P＜0.05

組別 n R 1(紅色熒光)正常細(xì)胞(%)R 2(綠色熒光)凋亡細(xì)胞(%)假手術(shù)組 1 0 3 0.2 6±5.0 9 6 9.6 7±5.0 3模型組 1 0 1 0.2 3±1.7 51) 8 9.9 5±1.5 61)電針內(nèi)關(guān)組 1 0 3 0.5 9±1 6.5 42)3) 6 9.0 9±1 6.5 52)3)電針環(huán)跳組 1 0 1 2.1 5±3.1 6 8 7.7 9±3.1 7

圖2 各組流式檢驗(yàn)結(jié)果

表3所示模型組凋亡細(xì)胞較假手術(shù)組有所升高(P＜0.01),則線(xiàn)粒體膜電位就越低;電針內(nèi)關(guān)穴組凋亡細(xì)胞較模型組和電針環(huán)跳組明顯下降(P＜0.05),則線(xiàn)粒體膜電位越高;而電針環(huán)跳穴組與模型組間無(wú)明顯差異(P＞0.05),電針環(huán)跳組與假手術(shù)組間也無(wú)明顯差異(P＞0.05)。以上結(jié)果提示電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以使MIRI大鼠線(xiàn)粒體膜電位升高。

3 討論

本研究選用在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型來(lái)模仿心肌梗死患者接受再灌注治療的臨床事件。心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是在心肌缺血恢復(fù)血流后,其細(xì)胞代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象,這種由再灌注誘發(fā)的一系列有害反應(yīng),損傷表現(xiàn)為心肌頓抑,心肌壞死和心肌凋亡等[13]。缺血再灌損傷的機(jī)制也較為復(fù)雜,參與因素眾多。

NO是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子,具有神經(jīng)介質(zhì)和調(diào)質(zhì)的功能,廣泛參與體內(nèi)生理和病理活動(dòng)。一氧化氮(NO)的合成需一氧化氮合成酶(NOS)的催化才能完成,NOS為一含鐵的單氧化酶,主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi),可催化左旋精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨和 NO[14],NO、NOS共同參與調(diào)控冠脈血管的收縮與舒張,對(duì)缺血后心功能的恢復(fù)及預(yù)后具有重要作用。但是NO在心肌缺血再灌注中是起保護(hù)因子作用抑或是起細(xì)胞毒性作用目前尚有爭(zhēng)議,NO可能發(fā)揮損傷或保護(hù)的雙重作用[15]。一些研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注模型組NOS活性增強(qiáng)、NO釋放增多,組織形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)肌原纖維內(nèi)大量收縮帶,肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,肌纖維內(nèi)脂滴增多,心肌細(xì)胞連接處電子密度降低,肌絲排列稀疏,潤(rùn)盤(pán)解離,局部肌纖維內(nèi)線(xiàn)粒體腫脹嵴疏松,部分嵴消失,心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重[16]。本研究中模型組血清NO和NOS含量明顯低于假手術(shù)組,說(shuō)明心肌缺血再灌注損傷能抑制NOS的活性,減少NO含量的生成;電針內(nèi)關(guān)穴組NO、NOS含量明顯多于模型組,說(shuō)明電針內(nèi)關(guān)穴可以提高NOS的活性,促進(jìn)NO的生成;而電針環(huán)跳組與模型組間NOS、NO含量無(wú)明顯差異,同時(shí)電針內(nèi)關(guān)組與電針環(huán)跳組相比NOS、NO含量明顯升高,說(shuō)明內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌損傷具有特異性的保護(hù)作用,為“胸脅內(nèi)關(guān)謀”臟腑經(jīng)脈理論提供依據(jù)。

線(xiàn)粒體膜電位是維持線(xiàn)粒體功能和結(jié)構(gòu)的根本,它的改變將會(huì)造成線(xiàn)粒體膜發(fā)生一系列的功能和狀態(tài)的變化。線(xiàn)粒體跨膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比,模型組出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降,破壞線(xiàn)粒體膜的完整性;同時(shí)與缺血再灌注組比,電針內(nèi)關(guān)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果說(shuō)明電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以提高心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位,減少心肌細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)心肌;與電針環(huán)跳組相比,電針內(nèi)關(guān)穴組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)意義,說(shuō)明內(nèi)關(guān)穴作為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴,對(duì)保護(hù)心肌具有特異性作用。

有研究報(bào)道,NO通過(guò)抑制復(fù)合體Ⅰ阻止線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激,能夠抑制線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(MPTP)的開(kāi)放,從而保持線(xiàn)粒體膜電位的穩(wěn)定,發(fā)揮再灌注心肌保護(hù)作用[17]。本課題組近10年來(lái),一直在研究電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠、家兔MIRI的保護(hù)作用及其機(jī)理,結(jié)果證明了電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)MIRI具有保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠的保護(hù)作用,其可能作用機(jī)制與電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理可以增加心肌組織 NO含量、提高NOS活力,減少心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降,穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位有關(guān),從而達(dá)到抑制心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌再灌注損傷的目的。同時(shí)也證實(shí)了內(nèi)關(guān)穴為保護(hù)心肌的特異性穴位,更好地為中醫(yī)治未病、臟腑經(jīng)脈理論、“胸脅內(nèi)關(guān)謀”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也給我們臨床電針內(nèi)關(guān)治療心血管疾病提供了保障。

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Effect of Point Neiguan(PC6) Electroacupuncture Pretreatment on NO, NOS and Mitochondrial Membrane Potential in Rats with Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

SONG Jin,WANG Chao,YANG Ren-da,FENG Guo,TAN Cheng-fu,LIU Wei-wei,YAN Jie.Hunan University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Massage,Changsha410208,China

ObjectiveTo explore the effect of point Neiguan(PC6) electroacupuncture pretreatment on nitric oxide(NO), nitric oxide synthase (NOS) and mitochondrial membrane potential by determining NO, NOS and mitochondrial membrane potential in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI).MethodForty male SD rats were randomized to sham operation, ischemia/reperfusion model, point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao(GB30) electroacupuncture groups, 10 rats each. The model was made by coronary artery ligation.Before model making, electroacupuncture was given to the point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao electroacupuncture groups, 20 min/d for a total of 7 d. T wave value in ECG lead Ⅱ was measured before and after model making. Myocardial pathomorphological changes were examined by HE staining. Serum NO and NOS contents were measured by a colorimetric nitrate reductase assay. Cardiomyocyte mitochondrial membrane potential was determined by fluorescence techniques.ResultSerum NO and NOS contents and mitochondrial membrane potential decreased significantly in the model group compared with the sham operation group (P＜0.05). Serum NO and NOS contents increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model,sham operation and point Huantiao electroacupuncture groups (P＜0.01, P＜0.05). Mitochondrial membrane potential increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model, point Huantiao electroacupuncture and sham operation groups (P＜0.01, P＜0.05). There was no statistically significant difference in mitochondrial membrane potential between the model and point Huantiao electroacupuncture groups (P＞0.05).ConclusionPoint Neiguan electroacupuncture pretreatment has a preventive protecting effect on MIRI rats. It produces a protecting effect on myocardium by increasing the NO content, strengthening NOS activity, reducing a decrease in cardiomyocyte mitochondrial membrane potential and inhibiting apoptosis.

Myocardial reperfusion injury; electroacupuncture; Point, Neiguan(PC6); Nitric oxide synthase;Mitochondrial membrane potential; Rats

R2-03

A

2017-03-25

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.10.1247

1005-0957(2017)10-1247-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81574080);湖南省中醫(yī)藥管理局課題(2015211);湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金項(xiàng)目(15k093); 2015年針灸推拿學(xué)湖南省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目(序號(hào)06)

宋瑾(1990—),女,2014級(jí)碩士生

王超(1974—),女,副教授,碩士生導(dǎo)師,碩士,Email：592436380@qq.com