葛宇新，張洋，田振華，于源華，郭瑞，張昊

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022；2.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

基于碳點(diǎn)標(biāo)記的（1-3）-β-D葡聚糖的熒光檢測(cè)方法

葛宇新1，張洋2，田振華2，于源華2，郭瑞2，張昊2

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022；2.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

血清中（1，3）-β-D葡聚糖（βG）的含量已經(jīng)成為臨床上檢測(cè)侵襲性真菌感染的指標(biāo)，利用原核表達(dá)并純化獲得能夠與βG特異性結(jié)合的美洲鱟屬G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，將Gαa蛋白與碳點(diǎn)偶聯(lián)獲得生物熒光傳感器“碳點(diǎn)/Gαa蛋白”，建立基于碳點(diǎn)標(biāo)記的βG熒光檢測(cè)方法。經(jīng)測(cè)定該傳感器的最佳的激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，其發(fā)射波長(zhǎng)為470nm，且熒光強(qiáng)度與βG濃度呈正線性相關(guān)，該檢測(cè)方法線性范圍是9.375～150pg/mL，最低檢測(cè)限為9.375pg/mL，批間、批內(nèi)精密度均不小于5%，準(zhǔn)確度（回收率）在97%～102%之間，該方法靈敏、快速、成本低，具有廣闊的應(yīng)用前景。

（1，3）-β-D葡聚糖；美洲鱟屬G因子α亞基片段a特異性蛋白；碳量子點(diǎn)；真菌感染

近三十年來，隨著器官移植、腫瘤化療、免疫抑制劑使用、創(chuàng)傷性醫(yī)療操作等的不斷增多，侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的發(fā)病率和病死率顯著上升。美國(guó)非艾滋病患者中致死性真菌感染的發(fā)病率逐年上升［1］。

真菌的細(xì)胞壁主要成分為（1，3）-β-D葡聚糖（βG）。當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理，βG從胞壁中釋放出來，使血液及其它體液中βG含量增高。在臨床上，正常人體血液中的（1，3）-β-D葡聚糖含量應(yīng)小于10pg/mL，若含量大于20pg/mL，可診斷此病人患有侵襲性真菌感染，當(dāng)含量在10pg/mL與20pg/mL之間，表明該檢驗(yàn)品有（1，3）-β-D葡聚糖存在，此人存在被侵襲性真菌感染的危險(xiǎn)［2，3］。生物標(biāo)志物（G和GM試驗(yàn)）分別被列入真菌診斷和治療的指南，歐洲癌癥治療研究組織和美國(guó)國(guó)家過敏癥與傳染病研究所霉菌病研究組批準(zhǔn)用于真菌診斷［4］。因此對(duì)βG進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)真菌感染的早期診斷并對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽性的患者及時(shí)進(jìn)行治療，是提高患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵［5-6］。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于檢測(cè)真菌（1，3）-β-D葡聚糖的方法主要為鱟試劑法：鱟試劑（鱟的血細(xì)胞提取物）在1983年首先收載于美國(guó)藥典。Fungitec-G glucan試劑主要成分是東方鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為 20ng/L［7］；而 Glcatell試劑則使用美洲鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為主要原料，使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)為60ng/L［8-9］。這種檢測(cè)方法靈敏度很高，但是鱟血屬于天然材料，易出現(xiàn)資源的枯竭，目前在某些地區(qū)鱟已經(jīng)被列為二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。由于鱟試劑的成本比較高，且需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)［10-11］。因此建立靈敏、簡(jiǎn)便、低成本檢測(cè)（1，3）-β-D葡聚糖的測(cè)定方法，對(duì)真菌感染早期診斷、治療效果和康復(fù)判斷具有重大意義。

近年來，熒光碳點(diǎn)（CDs）以高穩(wěn)定性、低毒性、低成本的優(yōu)勢(shì)，在各種生物檢測(cè)領(lǐng)域里起到很大的作用，熒光碳點(diǎn)具有獨(dú)特的性質(zhì)，碳點(diǎn)在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下會(huì)產(chǎn)生熒光，這種熒光在碳點(diǎn)與其他物質(zhì)結(jié)合后會(huì)隨著所加的物質(zhì)濃度的上升而出現(xiàn)熒光峰值的上升或是下降，或者熒光峰值會(huì)出現(xiàn)藍(lán)移或紅移［12-14］。研究這種現(xiàn)象的規(guī)律與檢測(cè)所加物質(zhì)濃度呈一定的關(guān)系，從而通過此規(guī)律達(dá)到對(duì)待檢測(cè)物未知濃度的檢測(cè)。

碳量子點(diǎn)因其粒徑小（1-10nm），從而具有獨(dú)特優(yōu)越的光學(xué)、電子和表面可修飾性等性質(zhì)，已成為納米生物光子學(xué)領(lǐng)域的新貴，被廣泛應(yīng)用在生物標(biāo)記領(lǐng)域。高質(zhì)量的碳量子點(diǎn)溶液具備以下特點(diǎn)：廣泛的尺寸范圍、較窄的尺寸分布、良好的穩(wěn)定性以及高熒光性。

通過鱟試劑可以檢測(cè)真菌感染，表示鱟血中存在某種特異性蛋白可以與真菌細(xì)胞壁的βG結(jié)合，因此在基因組文庫中篩選出能夠與βG特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)基因序列，利用基因重組技術(shù)，克隆該段基因，通過原核大量表達(dá)Gαa蛋白，過親和層析Ni柱純化蛋白，得到高純度蛋白質(zhì)可以與碳點(diǎn)通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合，構(gòu)建生物熒光傳感器，用于檢測(cè)樣品中（1，3）-β-D葡聚糖的含量。當(dāng)特異性蛋白質(zhì)與碳點(diǎn)結(jié)合物濃度固定時(shí)，樣品的熒光值的增加量在一定范圍內(nèi)與樣品所含βG量呈正相關(guān)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)儀器包括：Synergy2熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；96孔微孔黑板（美國(guó)Corning公司）；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)公司）；Tecnai G2 20透射電鏡（美國(guó)FEI公司）。

本實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)試劑包括：工程菌E.coli BL21-pET-15b-Gαa（上海生物工程有限公司構(gòu)建）；氨基修飾的碳點(diǎn)（蘇州大學(xué)贈(zèng)予）；（1，3）-β-D葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（購自上海源葉生物有限公司）；IPTG、N-乙基-N’-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（購自Sigma-Aldrich）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 重組菌的表達(dá)純化和純化

根據(jù)GenBank：AB547712.1上登記的美洲鱟屬G因子α亞基片段a（Gαa）的基因序列，大小是1251bp，合成 BL21-pET-15b-Gαa的工程菌。將含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21菌株接種到LB液體培養(yǎng)液中表達(dá)，表達(dá)條件是20℃，160rpm，LB培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1mM，培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，回收所得的沉淀物（菌體）。將沉淀物用PBS洗滌2次，然后用NPI-1（PBS，含有咪唑1 mmol/L，pH 7.4）重懸菌體，加入溶菌酶，通過反復(fù)凍融和超聲破碎，離心取上清。過Ni柱時(shí)按照上海悅克生物科技有限公司的Ni-NTA親和層析柱的說明書純化目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 碳點(diǎn)性質(zhì)

用透射電鏡掃描碳點(diǎn)，觀察碳點(diǎn)的形貌和大小。

用熒光分光光度計(jì)，檢測(cè)1mL的碳點(diǎn)，在不同的激發(fā)波長(zhǎng)下，觀察熒光光譜的變化，最終找到規(guī)律并選出最佳的激發(fā)波長(zhǎng)。

將碳點(diǎn)按照體積梯度稀釋，在紫外照射下用肉眼觀察樣品熒光光強(qiáng)的變化。用熒光分光光度計(jì)，輸入最佳的激發(fā)波長(zhǎng)，得到的熒光峰值，用峰值繪制曲線，研究熒光碳點(diǎn)的水溶性和均一性。

1.4 生物熒光傳感器的制備及檢測(cè)方法

用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量蛋白的濃度，用PBS緩沖溶液配制Gαa蛋白濃度為2.0mg/mL，用量6mL，加入5μL的EDC，在37℃下反應(yīng)30min，活化蛋白中的-COOH。用超濾離心管離心，將多余的EDC除去，然后加入2mL的碳點(diǎn)（-NH4修飾），37℃下反應(yīng)3h，制備成檢測(cè)真菌感染時(shí)（1，3）-β-D葡聚糖含量的生物熒光傳感器。

檢測(cè)原理是，利用碳點(diǎn)上帶有的-NH4與Gαa蛋白中-COOH發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，即將Gαa蛋白連在碳點(diǎn)上；加入待檢測(cè)物（1，3）-β-D葡聚糖，βG可與Gαa蛋白特異性氨基酸序列結(jié)合，從而進(jìn)一步增加碳點(diǎn)的的體積；而碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著待測(cè)物濃度的上升而出現(xiàn)熒光峰值上升的現(xiàn)象。通過分析熒光峰值上升程度與βG濃度之間關(guān)系，可以獲得βG檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而可以檢測(cè)溶液中的Gαa蛋白濃度。

為了保證碳點(diǎn)熒光的穩(wěn)定性，研究在不同溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值和在25mM Mg2+用量條件下對(duì)反應(yīng)的影響，根據(jù)反應(yīng)曲線最終確定最佳反應(yīng)條件。

在96孔黑板中加入200μL生物熒光傳感器和30μL用蒸餾水梯度稀釋的（1，3）-β-D葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入6μL Mg2+，在溫度37℃下反應(yīng)10min，放入熒光酶標(biāo)儀中，輸入最佳激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)參數(shù)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。設(shè)定含有（1，3）-β-D葡聚糖的樣品熒光光強(qiáng)與空白對(duì)照熒光光強(qiáng)之差為傳感器響應(yīng)值（熒光值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 方法學(xué)評(píng)估

對(duì)所建立的方法進(jìn)行了批間、批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)、準(zhǔn)確度（回收率）實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組目的菌的表達(dá)及純化

對(duì)重組工程菌采用IPTG誘導(dǎo)，使其表達(dá)Gαa蛋白，過Ni柱純化蛋白，向Ni柱中依次加入，BL21-pET-15b-Gαa總蛋白、NPI-1、NPI-20（PBS，含有咪唑 20mmol/L，pH 7.4）、NPI-30（PBS，含有咪唑 30mmol/L，pH 7.4）和 NPI-200（PBS，含有咪唑200mmol/L，pH 7.4），收集流出樣，經(jīng)過SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如蛋白電泳圖1所示，6號(hào)條帶為純化后的Gαa蛋白，純化產(chǎn)物在約40kDa處有一條明顯表達(dá)帶，與預(yù)期蛋白分子量相符，Gene Tools軟件分析結(jié)果顯示純化后Gαa蛋白含量達(dá)到85%。

圖1 Gαa蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化SDS-PAGE電泳

2.2 碳點(diǎn)表征

用透射電鏡掃描碳點(diǎn)，結(jié)果如圖2所示，得到其大小在1nm-10nm之間，符合正態(tài)分布，碳點(diǎn)的大小居中在5nm。說明該氨基修飾碳點(diǎn)均一性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 TEM對(duì)碳點(diǎn)的表征

2.3 碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度曲線

用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)碳點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)340nm～400nm下的熒光光譜變化，最終找到最佳的激光波段，如圖3所示，在360nm波長(zhǎng)的激發(fā)下，熒光發(fā)射光強(qiáng)在430nm時(shí)可達(dá)到最高值。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)生變化時(shí)，碳點(diǎn)的熒光光譜出現(xiàn)了紅移或是藍(lán)移現(xiàn)象，熒光峰值也隨之變化。

圖3 在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜

2.4 碳點(diǎn)的溶解性和均一性

將碳點(diǎn)用蒸餾水進(jìn)行5次稀釋，稀釋比例分別為1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。對(duì)溶液進(jìn)行紫外光照射，觀察溶液發(fā)射的熒光光強(qiáng)變化，如圖4左上方所示，碳點(diǎn)在紫外光下照射發(fā)出藍(lán)色的熒光，熒光光強(qiáng)隨著碳點(diǎn)的梯度稀釋而減弱。

用熒光分光光度計(jì)，檢測(cè)不同濃度的碳點(diǎn)，在檢測(cè)儀器中輸入最佳激發(fā)波長(zhǎng)360nm，檢測(cè)熒光光強(qiáng)的峰值并繪制曲線。如圖4所示，X軸為碳點(diǎn)的相對(duì)濃度，Y軸為最高熒光強(qiáng)度值，曲線R2=0.999，說明碳點(diǎn)的水溶性和均一性良好。

圖4 不同濃度碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化

2.5 實(shí)驗(yàn)原理圖

碳點(diǎn)-Gαa蛋白熒光生物傳感器檢測(cè)（1，3）-β-D葡聚糖原理如圖5所示，氨基修飾碳點(diǎn)與Gαa蛋白羧基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，合成熒光生物傳感器，該傳感器上的蛋白質(zhì)可與待檢測(cè)樣品中βG特異性結(jié)合，待反應(yīng)結(jié)束后熒光傳感器在激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm處進(jìn)行激發(fā)，檢測(cè)發(fā)射光熒光光譜。結(jié)果顯示在470nm處出現(xiàn)峰值，且隨著βG濃度增加，熒光光譜峰值也隨之增加。

圖5 實(shí)驗(yàn)原理

2.6 反應(yīng)條件的摸索

圖6 反應(yīng)條件的研究

對(duì)不同溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、和25mM Mg2+的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)數(shù)據(jù)的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)摸索。結(jié)果如圖6所示，圖6（a）為對(duì)反應(yīng)溫度的摸索，當(dāng)溫度從10℃增加到60℃時(shí)，可知37℃為最佳反應(yīng)溫度；圖6（b）為對(duì)溶液pH的摸索，溶液pH值在4～9的反應(yīng)體系時(shí)，可知偏中性pH=6.8為最佳反應(yīng)pH；圖6（c）為對(duì)反應(yīng)時(shí)間的摸索，當(dāng)時(shí)間從0min增加到60min時(shí)，從圖可知10min為最佳反應(yīng)時(shí)間；圖6（d）為25mM Mg2+的用量摸索，當(dāng)用量從0μL增加到12μL時(shí)，從圖可知6μL為最佳反應(yīng)用量。

2.7 （1，3）-β-D葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線

在黑色的酶標(biāo)板中加入200μL生物熒光傳感器和30μL用蒸餾水稀釋的βG，加入6μL的25mM Mg2+，在溫度37℃下反應(yīng)10min，用熒光酶標(biāo)儀在360nm激發(fā)，470nm檢測(cè)溶液發(fā)射的熒光光強(qiáng)。將測(cè)得的熒光值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖7所示，X軸為βG濃度，Y軸為實(shí)測(cè)熒光值減去空白熒光值，線性范圍是9.375-150pg/mL。對(duì)βG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得最低檢測(cè)限為9.375pg/mL。

圖7 不同濃度的βG在生物熒光傳感器中的熒光強(qiáng)度

2.8 方法學(xué)的評(píng)估

做5組平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)所建立的方法進(jìn)行了批間、批內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度（回收率）和穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果如表1所示，批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于5%，準(zhǔn)確度（回收率）在97%～102%之間，在7天內(nèi)，生物熒光傳感器保持穩(wěn)定。

表1 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的評(píng)估

3 結(jié)論

本文表達(dá)了與（1，3）-β-D葡聚糖特異性結(jié)合的美洲鱟G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，蛋白質(zhì)量為40kDa，濃度為2mg/mL。氨基化修飾碳點(diǎn)平均直徑5nm，具有良好的水溶性和均一性。文中采用EDC/NHS氨基與羧基脫水縮合反應(yīng)，將Gαa蛋白與碳點(diǎn)偶聯(lián)，構(gòu)建了定量檢測(cè)（1，3）-β-D葡聚糖的生物熒光傳感器，并對(duì)該熒光檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，熒光強(qiáng)度與（1，3）-β-D葡聚糖濃度呈正線性相關(guān)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=10.697x+148.52，R2=0.993，檢測(cè)下限9.375pg/mL。該方法批間和批內(nèi)變異系數(shù)CV均小于5%，準(zhǔn)確度（回收率）在97%～102%之間。

市售βG測(cè)定試劑盒均采用天然鱟血作為檢測(cè)試劑，鱟屬于二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，因此該方法不僅成本高，而且易出現(xiàn)資源枯竭，長(zhǎng)期將對(duì)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定造成破壞。本文原核表達(dá)了（1，3）-β-D葡聚糖特異性結(jié)合美洲鱟G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，與氨基化碳點(diǎn)偶聯(lián)，建立了熒光傳感檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)（1，3）-β-D葡聚糖的定量檢測(cè)，無需采集天然珍惜鱟血作為試劑，在降低檢測(cè)成本的同時(shí)，保護(hù)了野生生物資源。采用酶標(biāo)板可以實(shí)現(xiàn)高通量96個(gè)樣本的檢測(cè)，節(jié)約大量人力物力。本方法對(duì)（1，3）-β-D葡聚糖的檢測(cè)下限為9.375pg/mL，優(yōu)于市售（1，3）-β-D葡聚糖測(cè)定試劑盒的11pg/mL，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立的生物熒光傳感器定量檢測(cè)（1，3）-β-D葡聚糖的方法具有高靈敏、高特異性、快速、高通量、低成本的特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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A High Selective and Specific Fluorescent Test Method for The Detection of（1，3）-β-D-Glucan

GE Yuxin1，ZHANG Yang2，TIAN Zhenhua2，YU Yuanhua2，GUO Rui2，ZHANG Hao2
（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

The concentration of（1，3）-beta-D glucan（βG）in human serum is a clinical testing index of invasive fungal infection，a beta-glucan binding protein of horseshoe crab（limulus polyphemus）factor G-subunit α fragment-a（Gαa）was expressed in Escherichia coli BL21，Coupling of amination retouching carbon dots with G protein and establishing a“carbon dots/Gαa protein”fluorescent sensor for βG detection.The sensor excitation wavelength was 360 nm，emission wavelength was 460nm.The fluorescent and the concentration of βG were a positive linear correlation.，the detection range was 9.375～150pg/mL，the limit of detection was 9.375 pg/mL.The CV values within batch and between batches were all less than 5%，accuracy（recovery） were between 97%～102%.The novel fluorescent sensor for the detection of βG was low cost，rapid，high selective，sensitivity and specificity.

（1，3）-β-D-glucan；Gαa protein；carbon dots；fungus.

O613.71

A

1672-9870（2017）04-0133-05

2017-04-17

吉林省科技廳資助項(xiàng)目（20140309013YY）

葛宇新（1971-），女，本科，主管護(hù)士，E-mail：837349751@qq.com