黃玉敏，鄧勇，李德芳，趙立寧，唐慧娟，黃思齊

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

鎘脅迫對大麻幼苗生長及生理生化影響

黃玉敏，鄧勇，李德芳，趙立寧，唐慧娟，黃思齊*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

以3個主栽品種大麻（云麻1號、慶大麻、皖大麻1號）為材料，研究了不同鎘脅迫濃度（5、20、50μmol／L）對其種子萌發(fā)的影響。以“云麻1號”大麻為材料，研究了不同鎘脅迫濃度（5、20、50μmol／L）對大麻幼苗生長、根與葉 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶活性等的影響。結(jié)果顯示：種子萌發(fā)率隨鎘濃度升高而降低，發(fā)芽率依次為：云麻1號＞慶大麻＞皖大麻1號?！霸坡?號”大麻幼根伸長在CdCl2處理下較對照顯著降低，高濃度CdCl2處理，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，染色著色深，大麻幼根與葉片中MDA含量在20、50μmol／L CdCl2處理時較對照顯著升高。此外，鎘脅迫誘導(dǎo)“云麻1號”大麻幼根與葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。結(jié)果表明：鎘脅迫抑制大麻種子萌發(fā)、抑制“云麻1號”大麻幼根伸長；染色著色深、MDA含量增加可能與鎘脅迫引起脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜完整性有關(guān)；此外，大麻幼根與葉在鎘脅迫下可通過提高抗氧化酶SOD、POD活性來清除活性氧的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化，保護(hù)自身免遭氧化損傷。

大麻；鎘脅迫；生理生化反應(yīng)

鎘（Cadmium，Cd）是環(huán)境中一種常見的重金屬，具有較強的毒性和生物遷移性［1］，很容易被植物吸收，且在植物體內(nèi)累積，影響植物的生長和發(fā)育，亦可經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體，危害身體健康［2］。目前，根據(jù)我國環(huán)境保護(hù)部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，全國土壤重金屬超標(biāo)率為16.1%，其中，鎘的點位超標(biāo)率最高為7.0%，是中國耕地、林地、草地以及未利用地的主要污染物之一［3］。因此，預(yù)防和減少Cd污染，已經(jīng)成為一項緊迫任務(wù)。大麻（Cannabis sativa L.）作為一種經(jīng)濟作物，具有生長周期短、抗重金屬能力強、不易將重金屬帶入食物鏈等特點［4］，是目前研究修復(fù)鎘污染較好的材料。

作為一種不參與氧化還原反應(yīng)的重金屬，Cd可以很容易地在水中溶解并迅速被植物根部吸收［5］，植物在受到Cd脅迫時，會發(fā)生萎黃病，出現(xiàn)發(fā)育遲緩等現(xiàn)象［6］。苑麗霞等［7］對鎘脅迫下油菜生長發(fā)育過程中生理生化特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，低濃度的鎘對油菜生長起促進(jìn)作用，高濃度的鎘則抑制油菜生長。植物在受到Cd脅迫時，體內(nèi)也會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），抗氧化酶不能及時有效的清除，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化，其產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量增加，同時超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及其它保護(hù)酶的活性下降。隨著ROS積累過多，也會使膜脂產(chǎn)生脫酯化作用，磷脂游離，膜結(jié)構(gòu)被破壞。如果脅迫強度增大，或脅迫時間延長，植物就有可能死亡［8］。Panda等［9］研究了鎘脅迫誘導(dǎo)下水稻的氧化應(yīng)激反應(yīng)。劉俊［10］研究了Cd脅迫下黃瓜、番茄Cd生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)黃瓜根較于葉丙二醛（MDA）升高趨勢明顯，高濃度Cd會降低番茄中還原性糖含量，影響番茄品質(zhì)。

前人對于大麻響應(yīng)鎘脅迫生理活性研究較少。Citterio等［11］對大麻、玉米耐鎘、鉻、鎳等重金屬及其積累量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大麻對于重金屬的積累主要為根部，相比于玉米，大麻對重金屬的耐受性較強。曾民等［12］對4種大麻修復(fù)重金屬污染土壤能力做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低水平Pb、Zn、Cd處理對大麻株高及干物質(zhì)積累有輕微的促進(jìn)作用，而在高水平Pb、Zn、Cd處理下，4種大麻的生長均受到不同程度抑制，其對重金屬的耐性及富集能力依次為云麻2號＞云麻108號＞云麻1號＞云麻164號。本文分別選取生長于云南、安徽、黑龍江地域的主栽工業(yè)大麻品種云麻1號、皖大麻1號、慶大麻進(jìn)行研究，分析鎘毒害對其種子萌發(fā)的影響，并對耐鎘性強的大麻品種進(jìn)行生長指標(biāo)以及生理活性的測定，研究鎘脅迫對大麻幼苗生長以及生理生化的影響，以期為利用大麻修復(fù)鎘污染土壤提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用云麻1號、皖大麻1號、慶大麻，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所一年生麻類作物遺傳改良創(chuàng)新團隊提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 萌發(fā)試驗

選取籽粒飽滿、大小均勻的云麻1號、皖大麻1號、慶大麻種子各400粒，用10%的次氯酸鈉消毒10 min，雙蒸水反復(fù)沖洗，浸種催芽8 h后，置于鋪有3層濾紙培養(yǎng)盒里，每個培養(yǎng)盒里加入等體積不同濃度的CdCl2溶液，分別設(shè)置空白對照（CK）、5、20、50μmol／L 4個處理，空白對照用雙蒸水代替，每盒100粒種子，培養(yǎng)盒置于25℃培養(yǎng)箱中，黑暗條件下萌發(fā)72 h，統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。

1.2.2 幼苗培養(yǎng)

將未進(jìn)行鎘處理的幼苗轉(zhuǎn)移至等體積的1／4 Hogland營養(yǎng)液中進(jìn)行水培，培養(yǎng)5 d，條件如下：光周期16／8 h，晝夜溫度為30／26℃，相對濕度為60%，光強為700μmol·m2·s。Hogland營養(yǎng)液配方如下：Ca（NO3）25.79mmol／L，KNO38.02mmol／L，NH4H2PO41.35mmol／L，MgSO44.17 mmol／L，MnSO48.90μmol／L，H3BO348.3μmol／L，ZnSO40.94μmol／L，CuSO40.20μmol／L，（NH4）2MoO40.015μmol／L，F(xiàn)e－EDTA 72.6μmol／L，用 NaOH調(diào)節(jié) pH 5.8左右。

1.2.3 試驗設(shè)計

本試驗設(shè)置空白對照（CK）、5、20、50μmol／L 4個處理，待幼苗長至5 d，用 CdCl2溶液進(jìn)行處理，用營養(yǎng)液做空白對照，處理3天，重復(fù)3次。

1.2.4 根長測定

CdCl2處理開始，記為0，每隔1 d測一次根長，測到處理3 d為止。

1.2.5 3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色

將DAB粉末先溶于1 mol／L HCl中，完全溶解后，再溶于雙蒸水中，配制成0.75 mol／L的DAB溶液，剪取不同濃度CdCl2處理3 d的大麻幼苗根、葉，分別染色1、12 h，對照組用DAB溶液代替。95%酒精脫色，拍照。

1.3 取樣測定

鎘處理72 h后取樣，取各處理組的大麻幼苗，去離子水沖洗干凈。分別稱取大麻根、葉鮮重，冰水浴充分研磨，4000 r／min離心，取上清，分別用于MDA含量、SOD和POD活性檢測。

MDA含量和SOD、POD活性檢測均采用試劑盒法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel2016分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下不同大麻品種種子萌發(fā)情況

以幼芽長度相當(dāng)于種子一倍長作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計萌發(fā)3 d之后發(fā)芽數(shù)。如表1所示，不同水平Cd處理，發(fā)芽率不同，相比于對照組，發(fā)芽率都隨Cd處理濃度的升高而降低，其中，云麻1號相比于對照組發(fā)芽率降低14.8%；皖大麻1號相比于對照組發(fā)芽率降低19.4%；慶大麻相比于對照組發(fā)芽率降低15.5%。綜上，相同條件下，發(fā)芽率由高到低依次為：云麻1號＞慶大麻＞皖大麻1號?；诖舐榘l(fā)芽情況，選取云麻1號為相對耐鎘品種，進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 Cd脅迫下不同大麻品種種子萌發(fā)率Tab.1 The seed germination rate of different hemp varieties to Cd stress

2.2 鎘脅迫下大麻幼苗根生長情況

不同濃度Cd處理的大麻幼苗，隨著處理時間的增長，根生長情況不同。圖1結(jié)果表明，對照組，3 d之間，根由4.3 cm生長到7.7 cm，伸長約79%，其中，相比于對照，第1 d伸長達(dá)到顯著（p＜0.05），第2天達(dá)到極顯著（p＜0.01）。5μmol／L CdCl2處理組，根伸長約78%，其中，第1天，根伸長顯著高于對照（p＜0.05）。20μmol／L CdCl2處理組，伸長約43%，其中，第3天時，根伸長顯著高于對照（p＜0.05）。50μmol／L CdCl2處理組，根伸長約38%。由此可以得出：隨著處理時間不斷增加，CdCl2處理濃度越高，大麻幼苗根的生長越緩慢，高濃度的CdCl2對大麻幼苗根的生長有抑制作用。

圖1 不同濃度CdCl2處理大麻幼苗根長變化Fig.1 Effects of Cd on the root length of hemp seedlings

2.3 鎘脅迫下大麻幼苗根與葉DAB染色

DAB染色是一種常用的過氧化物酶（Peroxidase，POX）染色法，其原理是細(xì)胞內(nèi)的POX能將無色的DAB的氫原子傳遞給過氧化氫，使前者催化成有色染料沉積在細(xì)胞質(zhì)中的POX所在部位［13］。不同濃度的CdCl2分別處理大麻根部與葉，引起過氧化物酶增加，用DAB染色、脫色后，有明顯的棕紅色物質(zhì)出現(xiàn)。如圖2所示：對照組，大麻幼根呈正常色；5μmol／L CdCl2處理組，開始有棕紅色物質(zhì)積累；20μmol／L CdCl2處理組，棕紅色物質(zhì)積累增加；50μmol／L CdCl2處理組，大麻幼根呈棕色。隨著鎘處理濃度的增加，根部棕紅色物質(zhì)積累增加。如圖3所示：對照組，大麻葉片脫色后呈米白色；5μmol／L CdCl2處理組，脫色后，葉脈呈現(xiàn)出棕紅色；20μmol／L CdCl2處理組，葉脈與葉片均呈現(xiàn)棕紅色；50μmol／L CdCl2處理組，整個葉片呈現(xiàn)棕黑色。因此，CdCl2處理濃度越高，棕紅色物質(zhì)積累越多，對大麻毒性越大。

圖2 不同濃度 Cd2＋處理大麻幼苗根DAB染色Fig.2 The DAB staining of hemp seedlings under Cd stress

圖3 不同濃度Cd2＋處理大麻幼苗葉DAB染色Fig.3 The DAB staining ofhemp leaves under Cd stress

2.4 鎘脅迫對大麻幼根與葉MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，會影響植物的生長發(fā)育，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的良好指標(biāo)，也是經(jīng)常用來衡量植物對逆境反應(yīng)強弱的指標(biāo)之一［14］。如圖4所示：相比于對照，用5μmol／L CdCl2處理大麻幼根組織，MDA含量增加不顯著；而20、50μmol／L CdCl2處理組，MDA含量升高分別達(dá)到顯著（p＜0.05）和極顯著（p＜0.01）。如圖5所示：相比于對照，用5μmol／L CdCl2處理大麻葉片組織，MDA含量增加不顯著；而20、50μmol／L CdCl2處理組，MDA含量升高分別達(dá)到顯著（p＜0.05）和極顯著（p＜0.01）。因此，不同濃度CdCl2處理均可導(dǎo)致大麻幼苗根與葉組織中的MDA含量增加，且隨著鎘處理濃度的增加，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢。其原因在于，高濃度的CdCl2會誘導(dǎo)大麻幼苗根細(xì)胞與葉細(xì)胞發(fā)生膜質(zhì)過氧化，對細(xì)胞造成了明顯的毒害作用。

圖4 鎘脅迫對大麻幼根MDA含量影響Fig.4 Effect of Cd on MDA content in hemp roots

圖5 鎘脅迫對大麻幼葉MDA含量影響Fig.5 Effect of Cd on MDA content in hemp leaves

2.5 鎘脅迫對大麻幼根與葉SOD活性的影響

SOD是植物體內(nèi)一類重要的保護(hù)酶，在抗逆境脅迫中起著關(guān)鍵作用，其活性的變化被認(rèn)為是衡量植物體清除活性氧能力的重要標(biāo)志［15］。如圖6所示：不同濃度的鎘處理大麻根組織，相比于對照，5～20μmol／LCdCl2處理組，SOD活性呈上升趨勢，20μmol／LCdCl2處理組，上升3.6%。而50μmol／L CdCl2處理組，SOD活性開始呈下降趨勢，且下降幅度較大，降低約23%。如圖7所示：不同濃度的鎘處理大麻葉組織，0～5μmol／L CdCl2處理組，SOD活性呈上升趨勢，相比于對照，上升5.3%，而20μmol／L CdCl2處理組，SOD活性開始呈下降趨勢，50μmol／L CdCl2處理組，下降18.6%。由此說明：不同濃度的鎘處理大麻根與葉組織，在一定范圍內(nèi)，SOD活性都呈現(xiàn)出隨鎘濃度增加呈先上升后降低的趨勢，以此起到防御作用。

圖7 鎘脅迫對大麻幼葉SOD活性影響Fig.7 Effect of Cd on SOD activity in hemp leaves

2.6 鎘脅迫對大麻幼根與葉POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)一類應(yīng)對氧化應(yīng)激的重要酶，主要通過清除體內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物來保護(hù)細(xì)胞免受傷害［16］。如圖8所示：不同濃度的鎘處理大麻根組織，5μmol／L CdCl2處理組，POD活性呈上升趨勢，相比于對照，上升6.9%，而20μmol／L CdCl2處理組，POD活性開始呈下降趨勢，50μmol／L CdCl2處理組，相比于對照，下降2.4%。如圖9所示：不同濃度的鎘處理大麻葉組織，POD活性整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，5、20、50μmol／L CdCl2處理組，相比于對照，分別上升11.2%、9.4%、7%。因此，鎘脅迫會導(dǎo)致大麻幼苗葉組織POD活性上升，上升幅度與鎘處理濃度有關(guān)。

圖8 鎘脅迫對大麻幼根POD活性影響Fig.8 Effect of Cd on POD activity in hemp roots

圖9 鎘脅迫對大麻幼葉POD活性影響Fig.9 Effect of Cd on POD activity in hemp leaves

3 討論

3.1 鎘脅迫對大麻種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)階段為植物生長發(fā)育的重要階段，對Cd脅迫較為敏感，種子發(fā)芽力會降低。曾翔等［17］研究表明：在10 mg／L CdCl2處理下，水稻的萌發(fā)率相比于對照降低了1.3%，陳仲英等［18］分析了工業(yè)大麻萌發(fā)期及幼苗前期重金屬Pb耐性，發(fā)現(xiàn)Pb對大麻萌發(fā)有抑制作用。本研究中云麻1號、皖大麻1號、慶大麻發(fā)芽率與對照相比分別下降12%、14%、13.5%，其中，云麻1號耐鎘性相對較強。植物的耐鎘性大小是由植物的遺傳特性決定的，其中植物的發(fā)育階段和植物種類與其耐鎘性密切相關(guān)［19］。云麻1號耐鎘性強可能與其長時間處于鎘脅迫環(huán)境有很大關(guān)系。

3.2 鎘脅迫下大麻幼苗根生長情況

根是直接接觸和吸收重金屬的部位，對Cd毒害十分敏感。劉敏［20］認(rèn)為Cd脅迫會不同程度的抑制玉米幼根的伸長，且抑制程度隨著Cd處理濃度的增加而增加。本研究表明：隨著Cd處理濃度的增加，對大麻幼苗根生長抑制越明顯，20μmol／L CdCl2處理組抑制率為57%，50μmol／L CdCl2處理組抑制率達(dá)到62%。這可能由于過量Cd積累于大麻根部，對大麻產(chǎn)生明顯的毒害作用。

3.3 鎘脅迫下大麻幼苗根與葉DAB染色

POX是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類能催化很多反應(yīng)、以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的氧化還原酶，POX可使有毒物質(zhì)失活，利用過氧化氫等各種底物將有毒物質(zhì)氧化成無毒物質(zhì)，當(dāng)植物或微生物受到有毒物質(zhì)侵害時，體內(nèi)過氧化物酶會增加［13］。楊穎麗等［21］研究發(fā)現(xiàn)Cd2＋脅迫下，小麥通過增強POD酶的活性來清除葉片中的活性氧，使葉片免受氧化損傷。細(xì)胞中POX常用DAB來染色，著色程度表明POX含量多少，也表明植物體受毒害程度。本研究中：不同程度CdCl2處理大麻幼苗，經(jīng)過DAB染色，根與葉都表現(xiàn)出：著色程度均隨CdCl2處理濃度的增加而增加，其中，50μmol／L CdCl2處理根與葉，相比于對照，著色加深極為明顯，呈棕黑色。因此，CdCl2濃度越高對大麻幼苗毒性越大，POX增加越多，對機體損傷越嚴(yán)重。

3.4 鎘脅迫對大麻幼根與葉MDA含量的影響

逆境環(huán)境中，需氧植物細(xì)胞會產(chǎn)生過量的自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量MDA，進(jìn)而破壞細(xì)胞質(zhì)膜，大量胞內(nèi)電解質(zhì)外滲［22］。吳旭紅等［23］研究發(fā)現(xiàn)，50 mg／L Cd2＋處理的大豆幼苗，分泌物溶液電導(dǎo)率增加達(dá)到極顯著，可能是由于逆境下膜脂過氧化產(chǎn)物MDA在體內(nèi)積累導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的損傷所致。目前，普遍認(rèn)為植物不同組織MDA含量能反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化強弱以及細(xì)胞質(zhì)膜變性程度［24］。本研究結(jié)果表明，受CdCl2脅迫影響，大麻幼苗根與葉組織脂質(zhì)過氧化非常明顯，MDA含量隨著CdCl2處理濃度的增加而增加，幼苗受到的毒害作用也越大。

3.5 鎘脅迫對大麻幼根與葉SOD活性的影響

SOD作為生物應(yīng)對氧化應(yīng)激的一種重要酶，在抵御重金屬脅迫中起著重要作用，SOD主要通過清除O2－來降低膜脂的過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受侵害［25］。本研究結(jié)果表明：隨CdCl2處理濃度增加，大麻幼苗根與葉SOD活性均表現(xiàn)為先上升后降低的趨勢，幼根與葉分別在50、20μmol／L CdCl2處理時，SOD活性表現(xiàn)為下降趨勢。Cd脅迫使得大麻幼根與葉中產(chǎn)生過量O2－，大麻自身通過增加SOD活性清除過量的O2－，抵御Cd毒害。SOD活性變化與CdCl2處理濃度有關(guān)。

3.6 鎘脅迫對大麻幼根與葉POD活性的影響

H2O2積累是植物組織遭受氧化脅迫的一個重要特征，POD作為植物體內(nèi)一種應(yīng)對脅迫反應(yīng)較為敏感的保護(hù)酶，有研究［26］指出，其可能通過減少H2O2的積累來降低膜脂過氧化。本文研究結(jié)果表明：隨CdCl2處理濃度增加，大麻幼根與葉POD活性表現(xiàn)為先增高后降低趨勢，Cd脅迫對大麻幼苗根與葉造成了不同程度的氧化損傷，POD活性升高，通過清除H2O2等活性氧來保護(hù)大麻幼苗免受傷害。

綜上所述，大麻幼苗受鎘毒害程度隨鎘處理濃度的增加而加重。表現(xiàn)出：在較高的鎘脅迫下，其幼根生長明顯受抑制；DAB染色，根與葉均著色明顯。而植株自身則通過提高抗氧化酶SOD、POD活性來抵御鎘脅迫。

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Effect of Growth and Physiology－Chemistry of Hemp（Cannabis sativa）Seedlings under Cadmium Stress

HUANG Yumin，DENG Yong，LIDefang，ZHAO Lining，TANG Huijuan，HUANG Siqi*
（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

Threemain cultivars of Hemp（Yunma No.1，Qingdama，Wandama No.1）were employed to analyze changes of seed germination in response to CdCl2stress with different concentrations（5μmol／L，20μmol／L and 50μmol／L）.The Hemp of“Yunma No.1”was used to study seedling growth，3，3＇－diaminobenzidine staining on roots and leaves，MDA content，and physiological properties in response to cadmium stress with different concentrations（5μmol／L，20μmol／L and 50μmol／L）.The results shows：The rate of seed germination decreased with the increase of cadmium concentration，and the germination ratewas as follows：Yunma No.1＞Qingdama＞W(wǎng)andama No.1.The rootelongation of“Yunma No.1”decreased remarkably under each CdCl2concentration in comparison with control；meanwhile，high concentration of CdCl2induce lipid peroxidation，deep staining，and the MDA content of root and leaves was significantly increased at 20μmol／L，50μmol／L CdCl2treatment compared with control.In addition，cadmium stress induced the activity of SOD and POD in roots and leaves of“Yunma No.1”which increased first and then decreased.In conclusion，cadmium stress inhibited the seed germination and the seedlings elongation of“Yunma No.1”；deep staining and the incresing of MDA contentmay be associated with lipid peroxidation，destruction of cell membrane integrity caused by cadmium stress.Additionally，the root and leaves of hemp can reduce the activity of reactive oxygen species，decrease the lipid peroxidation and protect itself from oxidative damage by increasing the activities of SOD and POD.

hemp；cadmium stress；physiology－chemistry reaction

S563.3

A

1671－3532（2017）05－0227－07

2017－08－02

國家重點研發(fā)計劃專項（2017YFD0801105）

黃玉敏（1993－），女，在讀碩士，主要從事大麻非生物脅迫逆境機理研究。E－mail：2697565671＠qq.com

*通訊作者：黃思齊（1982－），男，副研究員，主要從事紅麻、大麻育種以及非生物脅迫逆境機理研究。E－mail：siqihuang＠caas.cn