葉 菁 岳希潔 蔣雪薇， 羅曉明 陳代文 吳 健 李赤翎

(1. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 益陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與信息工程系，湖南 益陽 410600；3. 廣東益鮮美生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 513300)

釀酒酵母低滲敏感性突變株的選育

葉 菁1岳希潔2蔣雪薇1，3羅曉明1陳代文3吳 健1李赤翎1

(1. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 益陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與信息工程系，湖南 益陽 410600；3. 廣東益鮮美生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 513300)

為促進(jìn)釀酒酵母胞內(nèi)產(chǎn)物的有效釋放，以其野生型二倍體(2n)菌株Y1為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變處理，通過測定其胞外FDP濃度及核酸、蛋白質(zhì)滲透率，對比各突變株在低滲條件下的自溶程度。結(jié)果表明：突變株Hs5*(n)低滲培養(yǎng)時，條件性自溶程度最高，其胞外FDP濃度達(dá)25.82 μg/mL，低滲培養(yǎng)6 h時，其核酸、蛋白質(zhì)滲透率高達(dá)1.86，2.07。此外突變株Hs2*(n)、Hs1(2n)也具有較好的條件性自溶能力。試驗(yàn)共篩選獲得3株低滲敏感性突變株，與野生型菌株相比，條件性自溶的低滲敏感性突變株能有效促進(jìn)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的外泌。

釀酒酵母；紫外誘變；低滲敏感性突變株；條件性自溶

Abstract： In order to improve the efficient secretion of intracellular product inSaccharomycescerevisiae, wild diploid Y1(2n) were mutagenized with UV treatment as original strain. To further identify, the degree of autolysis of each mutant strain was contrasted in low permeability condition by the test of its content of FDP, extra-cellular nucleic acids and proteins. The results showed: Hs5*(n)showed the highest degree of conditional autolysis in low permeability condition, the concentration of FDP in extracellular environment was 25.81 μg/mL. At the sixth hour in low permeability, its penetration rate of nucleic acid and protein in extracellular environment were 1.86 and 2.07, respectively. In addition, mutant strain Hs2*(n), Hs1(2n)also had a great extent of conditional autolysis capacity. These three low-permeability mutant strains obtained in this study possessed greater efficiency of intracellular product secretion contrast with wild strain.

Keywords：Saccharomycescerevisiae; UV mutagenesis; low-permeability mutant; conditional autolysis

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是生物技術(shù)領(lǐng)域最常用的真核外源基因表達(dá)系統(tǒng)[1]，但其堅(jiān)硬的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜是阻礙胞內(nèi)產(chǎn)物釋放的主要屏障[2]，因此如何促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)及外源蛋白的高效分泌成為研究熱點(diǎn)。目前提高胞內(nèi)物質(zhì)釋放的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法，其中物理法和化學(xué)法是目前最常采用的手段，這2種方法雖然效果明顯但也存在著不足[3-5]。物理法以脈沖電場、超聲波等方法為主，對儀器設(shè)備要求較高；化學(xué)法主要采用溶劑破碎，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生改變。此外，采用基因工程手段改造外源基因中的信號肽，增強(qiáng)外源蛋白的分泌能力也是研究的主流方向[6-7]，但此法技術(shù)難度高、處理步驟復(fù)雜。

相比之下，采用傳統(tǒng)的遺傳育種方式篩選條件致死突變株顯得更為安全、簡便。條件致死突變株的突變位點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生在細(xì)胞壁(膜)的相關(guān)基因上，導(dǎo)致其在相應(yīng)的條件下細(xì)胞通透性增大，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自溶，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外[8]。目前，常見的條件致死酵母菌株主要有三類：溫度敏感突變株[8]、高滲脅迫突變株[9]以及低滲敏感突變株[10]。課題組[11]前期研究過程中以釀酒酵母Y1為出發(fā)菌株，誘變選育出一株溫度敏感突變酵母菌Ts4，37 ℃培養(yǎng)時其胞內(nèi)大分子物質(zhì)分泌能力明顯提升，證明了條件致死突變株能有效釋放胞內(nèi)產(chǎn)物?；诖?，本研究擬繼續(xù)對釀酒酵母Y1進(jìn)行誘變處理，采用等滲、低滲培養(yǎng)基對比培養(yǎng)進(jìn)行初篩，再以胞外1、6-二磷酸果糖(Fructose-1, 6-diphosphate, FDP)濃度及胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸滲透率為復(fù)篩指標(biāo)，篩選出具有高蛋白外泌水平的低滲敏感性突變株(Hypotonic-sensitive mutant, Hs)，旨在豐富釀酒酵母條件致死菌株類型，并為快速構(gòu)建有效釋放胞內(nèi)產(chǎn)物的宿主系統(tǒng)提供更為簡單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)Y1：長沙理工大學(xué)食品與發(fā)酵研究所分離并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化斜面培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基[12]242；

生孢子培養(yǎng)基：Meclary培養(yǎng)基[12]244；

種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)液[13]；

YEPDK培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加4.5% KCl；

YEPDS+K培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加4.5% KCl和0.004%十二烷基磺酸鈉(SDS)；

YEPS培養(yǎng)基：用蔗糖代替YEPD培養(yǎng)基中的葡萄糖；

YEPDS培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基中添加0.004%十二烷基磺酸鈉(SDS)；

發(fā)酵培養(yǎng)基：在YEPDS培養(yǎng)液中添加0.2% MgCl2。

1.1.3 儀器

顯微成像系統(tǒng)：Eclipse E200型，尼康儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV1800型，日本島津公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：ZWY-2102C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

高速離心機(jī)：臺式TGL-16G型，常州諾基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 菌株Y1在28 ℃、160 r/min下培養(yǎng)12 h，無菌生理鹽水離心洗滌3次，制成108CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.2 紫外誘變及突變株的篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，對Y1菌的二倍體(2n)及單倍體(n)菌懸液進(jìn)行紫外誘變，將誘變后的酵母菌懸液梯度稀釋，影印接種于YEPDK、YEPDS平板上，28 ℃、培養(yǎng)48 h。挑選在YEPDK上正常生長，而在YEPDS上微生長或不生長的突變株進(jìn)入復(fù)篩；取初篩挑選的菌株依次接種于YEPD、YEPDK、YEPDS、YEPS、YEPDS+K平板上，再次篩選低滲透壓時微生長或不長的菌株[2]。

1.2.3 FDP含量的測定 參考文獻(xiàn)[14]，并采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算發(fā)酵液菌體濃度，以每毫升發(fā)酵液中107個細(xì)胞計(jì)算FDP含量。

1.2.4 酵母核酸、蛋白質(zhì)滲透率的測定 取篩選獲得的突變株依次進(jìn)行活化、種子培養(yǎng)基培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)3 h時添加SDS 0.04 g/L)。取兩份發(fā)酵液，其中一份采用紫外分光光度法直接測定菌體密度(OD600)，另一份先80 ℃水浴 5 min，再10 000 r/min離心20 min，取上清液，分別測定OD260、OD280，按式(1)、(2)計(jì)算胞外核酸滲透率(LD260)、蛋白質(zhì)滲透率(LD280)。

(1)

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母子囊孢子的制備

通常條件下酵母細(xì)胞以二倍體的形式存在，進(jìn)行出芽生殖，但在特殊條件誘導(dǎo)下(以醋酸鈉為唯一碳源，缺乏氮源)，可以進(jìn)行有性繁殖，產(chǎn)生2～4個單倍體有性孢子[15]，即子囊孢子，釀酒酵母產(chǎn)生的子囊孢子是人工選育優(yōu)良雜交酵母菌株的重要基因純核系來源[16]。將釀酒酵母Y1二倍體(2n)接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)一周，篩選獲得其單倍體(n)，并通過顯微鏡下觀察，檢驗(yàn)其二倍體生孢子情況，孔雀綠—番紅染色后見圖1?？梢钥闯觯邴?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時，Y1二倍體(2n)營養(yǎng)細(xì)胞易轉(zhuǎn)變生成子囊，這時細(xì)胞核進(jìn)行減數(shù)分裂，形成子囊孢子。

圖1 釀酒酵母Y1子囊孢子染色圖(100×)

2.2 低滲敏感性突變株的篩選及生長特征鑒定

釀酒酵母的營養(yǎng)體多以二倍體(2n)的形式存在，但其單倍體(n)的突變率相對較髙，且單倍體(n)突變株經(jīng)重新結(jié)合形成二倍體(2n)后，誘變所獲得的性狀才能較穩(wěn)定地遺傳下去[17]。因此，同時以酵母二倍體(2n)、單倍體(n)為出發(fā)菌株，采用紫外線對菌株Y1的二倍體(2n)及單倍體(n)菌株分別照射30 s，4.5 min，利用影印培養(yǎng)法對等滲及低滲條件下菌株的生長狀況進(jìn)行對比初篩，獲得低滲敏感性突變株，結(jié)果見圖2及表1、2。由圖2可知，圓圈標(biāo)出的突變株在等滲培養(yǎng)條件下(YEPDK培養(yǎng))生長正常，但在低滲培養(yǎng)條件下(YEPDS培養(yǎng))生長微弱甚至無法生長；表1、2顯示，根據(jù)等滲平板與低滲透平板菌落生長對照情況，篩選出8株二倍體(2n)、7株單倍體(n)低滲敏感性突變株。

表1 釀酒酵母二倍體(2n)突變菌株生長譜?

? Y1為出發(fā)菌株；“-”為不生長；“+/-”為生長微弱；“+”為正常生長；“++”為生長旺盛。

表2 釀酒酵母單倍體(n)突變菌株生長譜?

? Y1為出發(fā)菌株；“-”為不生長；“+/-”為生長微弱；“+”為正常生長；“++”為生長旺盛。

圖2 影印培養(yǎng)篩選低滲敏感性突變株

低滲培養(yǎng)基(YEPDS)中添加了表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，SDS能形成低滲環(huán)境，并作用于細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外，進(jìn)而引起酵母細(xì)胞的自溶[18]。由表1、2可知，出發(fā)菌株Y1(2n，n)在等滲培養(yǎng)基(YEPDK)、等滲保護(hù)培養(yǎng)基(YEPDS+K)、低滲培養(yǎng)基1(YEPS)及低滲培養(yǎng)基2(YEPDS)中均能生長，說明其不具有低滲敏感性。而Hs1、Hs2*、Hs5* 3株突變株在YEPDK上均生長旺盛，在低滲培養(yǎng)基(YEPDS)上則生長被抑制，且當(dāng)在低滲培養(yǎng)基中添加4.5%氯化鉀(YEPDS+K)后3株突變株的生長均得到部分恢復(fù)，因此選擇突變株Hs1、Hs2*、Hs5*作進(jìn)一步分析。對比發(fā)現(xiàn)，Hs1、Hs2*、Hs5*存在一些特性差異，在酵母菌常規(guī)培養(yǎng)基(YEPD)上，Hs1、Hs2*生長狀況一般，而Hs5*生長茂盛，說明常規(guī)條件下Hs5* 更易繁殖；在低滲條件相對較弱的培養(yǎng)基(YEPS)上Hs1、Hs5*生長微弱，而Hs2*則正常生長，說明Hs1、Hs5*的滲透壓敏感性強(qiáng)于Hs2*，因此，初步推測Hs1、Hs2*、Hs5*為低滲敏感性突變株，且Hs5*在低滲時更易發(fā)生自溶。

2.3 低滲敏感性突變株自溶程度考察

2.3.1 低滲敏感性突變株胞外FDP測定 FDP是酵母細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑中的中間產(chǎn)物，由于其不斷參與代謝反應(yīng)所以存在時間非常短。正常情況下，未經(jīng)處理的細(xì)胞其通透性較差，F(xiàn)DP在胞外很難得到積累[19]，而低滲敏感性突變株在低滲條件下細(xì)胞的通透性發(fā)生改變，培養(yǎng)液中 FDP 的濃度升高，因此FDP是衡量酵母細(xì)胞低滲敏感程度的重要指標(biāo)。測定釀酒酵母及其突變株在低滲條件下培養(yǎng)2 h時的菌體濃度及其胞外FDP濃度，菌體濃度以數(shù)量級107個為單位，計(jì)算出FDP在發(fā)酵液中的濃度，結(jié)果見圖3、4。由圖3可知，在釀酒酵母二倍體突變株中，Hs1胞外FDP含量最高，為出發(fā)菌株的1.55倍，說明二倍體突變株中Hs1的滲透壓敏感性最強(qiáng)。由圖4可知，在釀酒酵母單倍體突變株中，Hs2*、Hs5*的胞外FDP濃度明顯高于其它菌株，分別為出發(fā)菌株的1.94、2.37倍。由圖3、4可以確定Hs1、Hs2*、Hs5* 3株突變株為低滲敏感性突變株，其中Hs5*低滲敏感性最強(qiáng)，其細(xì)胞外FDP濃度達(dá)25.82 μg/mL。

2.3.2 低滲敏感性突變株核酸、蛋白質(zhì)胞外滲透率測定 正常情況下難以分泌到胞外的大分子物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)滲透率也是可以衡量酵母細(xì)胞自溶程度的重要指標(biāo)。對比分析添加SDS前后突變株Hs1、Hs2*、Hs5* 以及發(fā)菌株Y1的核酸、蛋白質(zhì)滲透率，結(jié)果見圖5、6。由圖5、6可知，突變株Hs1、Hs2*、Hs5* 核酸、蛋白質(zhì)滲透率均明顯大于出發(fā)菌株，說明紫外誘變導(dǎo)致突變株的細(xì)胞壁/膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，當(dāng)其處于低滲環(huán)境時會出現(xiàn)適度自溶，因此胞外大分子物質(zhì)含量增大。此外從圖5、6還可以看出，出發(fā)菌株Y1在添加SDS前后的核酸、蛋白質(zhì)滲透率變化很小，而突變株核酸、蛋白質(zhì)的滲透率隨著添加SDS發(fā)酵時間的延長而越來越高，其原因是突變株在低滲環(huán)境中生長微弱，同時細(xì)胞溶脹作用引起了膜不可逆的破壞，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的外泌[20]。其中Hs5* 大分子滲透率最大，發(fā)酵6 h時，其胞外核酸、蛋白質(zhì)滲透率分別達(dá)2.07，1.86，為出發(fā)菌株的3.22倍及3.64倍。由此證明突變株Hs1、Hs2*、Hs5*屬于具有大分子外泌能力的低滲敏感性突變株，且Hs5*在低滲條件下展現(xiàn)出最強(qiáng)的外泌特性。

圖3 二倍體突變株胞外FDP濃度

圖4 單倍體突變株胞外FDP濃度

圖5 突變株核酸滲透率

圖6 突變株蛋白質(zhì)滲透率

3 結(jié)論

釀酒酵母作為外源基因最理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，其細(xì)胞通透性對胞內(nèi)產(chǎn)物的有效釋放具有重要意義。通過簡單的誘變處理，利用低滲培養(yǎng)基定向篩選出3株低滲敏感性自溶突變株，即Hs1、Hs2*、Hs5*。對比其低滲條件下自溶程度可以發(fā)現(xiàn)：Hs5*突變株自溶程度最高，其胞外FDP濃度達(dá)25.82 μg/mL，為出發(fā)菌株的2.37倍，核酸及蛋白質(zhì)滲透率分別為2.07，1.86，為出發(fā)菌株的3.22倍及3.64倍，可以較大程度地提高釀酒酵母對外源蛋白的分泌能力。將低滲敏感突變株Hs5*與前期篩選的溫度敏感突變株Ts4對比分析發(fā)現(xiàn)Hs5*具有更強(qiáng)的胞內(nèi)物質(zhì)釋放能力。

溫度和滲透壓在微生物培養(yǎng)中都是易于控制的條件，篩選對滲透壓、溫度敏感性強(qiáng)的目標(biāo)菌株，有利于簡化胞內(nèi)產(chǎn)物的提取工藝，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Breeding of low-permeability sensitive mutant from Saccharomyces cerevisiae

YE Jing1YUEXi-jie2JIANGXue-wei1，3LUOXiao-ming1CHENDai-wen3WUJian1LIChi-ling1

(1.SchoolofChemical&BiologicalEngineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China; 2.CollegeofBiological&InformationEngineering,YiyangVocationa&TechnicallCollege,Yiyang,Hunan410600,China; 3.GuangdongYixianmeiBIO-SCICo.,Ltd,Qingyuan,Guangdong513300,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.006

長沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (編號：K1403029-11)；清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2013A024，2014A023)；湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目(編號：2015GCZX07)

葉菁，女，長沙理工大學(xué)在讀碩士研究生。

蔣雪薇(1972—)，女，長沙理工大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。E-mail：jxw_72@sina.com 李赤翎(1966—)，女，長沙理工大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，博士。E-mail：baiweili2005@163.com

2017—05—24