李向茸， 王興隴， 令 瑛， 徐 雷， 李瓊毅， 張海霞， 包曉婧， 馮若飛

(1. 西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730030； 2. 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心, 蘭州 730030； 3. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730030)

重組人白細(xì)胞介素7在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定分泌表達(dá)

李向茸1,2， 王興隴3， 令 瑛3， 徐 雷3， 李瓊毅3， 張海霞1,2， 包曉婧3， 馮若飛1,2

(1. 西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730030； 2. 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心, 蘭州 730030； 3. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 蘭州 730030)

通過構(gòu)建人白細(xì)胞介素7的重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)IL-7在HEK293細(xì)胞中的穩(wěn)定分泌表達(dá)，為生產(chǎn)試劑級(jí)的IL-7奠定基礎(chǔ)。從質(zhì)粒pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7中擴(kuò)增人IL-7全長基因，并將其構(gòu)建于pcDNA3.1真核表達(dá)載體上。利用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)G418篩選及單克隆，獲得穩(wěn)定分泌表達(dá)IL-7的HEK293-rIL-7細(xì)胞系。成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rIL-7，并實(shí)現(xiàn)IL-7在HEK293細(xì)胞上的穩(wěn)定分泌表達(dá)，最終獲得了1株表達(dá)量較高的細(xì)胞株，命名為HEK293-IL7-2G3細(xì)胞，培養(yǎng)48 h的細(xì)胞上清中IL-7的含量為3.2 ng/mL。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)人白細(xì)胞介素7在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分泌表達(dá)及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

白細(xì)胞介素7；轉(zhuǎn)染；綠色熒光蛋白；分泌表達(dá)

AbstractThe objective of this study was to construct eukaryotic expression vector of human interleukin-7, and make it expressed in HEK293 cells.IL-7 gene was amplified by PCR from the lentivirus expression vector pLV-CMV-EF1-GPL-rIL-7, and then cloned into the pcDNA3.1 vector to construct eukaryotic expression vector pcDNA3.1-rIL-7. The constructed plasmid was transfected into the HEK293 cells via LipofectamineTM2000 separately and screened by G418 continuously. By G418 screening and monoclonal, stably secreting expression IL-7 cell line HEK293-rIL-7 was obtained, successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1-rIL-7, and expressed in HEK293 cells. By cell cloning, one cell line with high secretory expression was obtained, named HEK293-rIL7-2G3. The content of IL-7 in the supernatant after 48 h was 3.2 ng/mL.

KeywordsIL-7; transfection; green fluorescent protein; secretory expression

白細(xì)胞介素(Interleukin, IL)，簡稱白介素，是由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的淋巴因子，在信息傳遞，免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用[1]。白細(xì)胞介素7(Interleukin-7, IL-7)又稱淋巴生成素1(Lymphopoeitin-1, LP-1)，是白細(xì)胞介素家族中的一員，屬于促紅細(xì)胞生成素家族Ⅰ型短鏈細(xì)胞因子[2]。IL-7基因全長1589 bp，位于8q12-13[3]，完整的ORF區(qū)內(nèi)含534個(gè)堿基對，編碼177 個(gè)氨基酸，未經(jīng)糖基化修飾的IL-7分子質(zhì)量為17.4 ku，而成熟的IL-7蛋白分子質(zhì)量約為25 ku，含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，編碼152個(gè)氨基酸[4-5]。人IL-7是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾臟細(xì)胞和皮膚角化細(xì)胞等產(chǎn)生的糖蛋白[6]，在肝、脾、胸腺等組織中亦可檢測到hIL-7 mRNA的表達(dá)。IL-7為一種多效細(xì)胞因子，免疫效應(yīng)廣泛，對于T細(xì)胞生長、增殖及分化等多方面有重要作用[7-8]。人們試圖利用IL-7 來治療疾病，如腫瘤[9]、艾滋病[10]、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等[11]，且在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-7 能改善癥狀或有效地治療這些疾病，為人類最終戰(zhàn)勝這些疾病帶來希望。

IL-7目前可通過重組技術(shù)制造應(yīng)用于人體，國外最早應(yīng)用的人重組IL-7(IL-7, CYT99007)由大腸埃希桿菌產(chǎn)生，現(xiàn)在研究應(yīng)用的IL-7(CYT107)是由Cytheris SA 使用重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系制造的第二代重組人IL-7產(chǎn)物。現(xiàn)今，在全球范圍內(nèi)登記在冊的合并IL-7應(yīng)用的臨床實(shí)驗(yàn)多達(dá)15個(gè)，應(yīng)用方法均為皮下注射[2]。目前這些試驗(yàn)得出以下一致結(jié)論：利用IL-7進(jìn)行生物治療是安全有效的[2]。然而國內(nèi)關(guān)于IL-7的研究較少，且均為大腸桿菌[12]和酵母細(xì)胞[13-15]表達(dá)，暫無IL-7上市的信息。本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建人IL-7基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-rIL-7，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選，實(shí)現(xiàn)IL-7在HEK293細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)人白細(xì)胞介素7在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分泌表達(dá)及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞和試劑

E.coliDH5α、慢病毒表達(dá)載體pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒、BL21(DE3)菌株、人胚腎細(xì)胞(HEK293)均由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、TIANScript M-MLV、TaqDNA聚合酶、高純度質(zhì)粒小提試劑盒及增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；EcoRⅠ內(nèi)切酶、NotⅠ內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；100 bp DNA ladder、1kb DNA ladder均購自中科瑞泰生物科技有限公司； G418購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；非預(yù)染蛋白Marker購自Bio-rad公司；PVDF 膜購自Solarbio公司；Mouse Anti-IL-7抗體、IL-7 ELISA試劑盒購自美國Abcam公司；山羊抗小鼠-HRP購自美國Jackson公司。

1.2 人IL-7引物及基因的擴(kuò)增

根據(jù)pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7的核苷酸序列和pcDNA3.1載體序列，用Primer Premier 5.0等軟件設(shè)計(jì)引物YIL-7-F/R，并由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成(注：斜體部分為保護(hù)堿基，下劃線部分分別為EcoR I及NotI酶切位點(diǎn))。

表1 引物名稱及序列

以pLV-CMV-EF1-GP-rIL-7載體為模板，用IL-7基因的特異引物YIL-7-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，69℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)； 72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 重組表達(dá)載體pcDNA3.1-rIL-7的構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后，與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-IL-7。分別用EcoR I +NotI雙酶切pMD18-T-IL-7和pcDNA3.1載體，之后分別進(jìn)行純化，然后用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α、單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，依次進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，測序鑒定完全正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-rIL-7。

1.4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-rIL-7轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

1.4.1 HEK293細(xì)胞G418最佳篩選濃度的確定

將HEK293細(xì)胞按1×105cells/孔 鋪于24孔板中，然后取不同濃度梯度的G418加入24孔板中，G418的濃度梯度為0、200、400、600、800和1000 μg/mL。培養(yǎng)10～14 d并每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.4.2 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將處于對數(shù)生長期并生長良好的HEK293細(xì)胞以1×106cells/mL接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日將細(xì)胞用無血清opti-MEM洗2遍，然后每孔加入1.5 mL opti-MEM。分別將空載質(zhì)粒pcDNA3.1、陽性對照質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP及重組質(zhì)粒pcDNA3.1-rIL-7用opti-MEM稀釋后按比例加入至同樣用opti-MEM稀釋的Lipofectamine2000中，20 min后將混合液分別逐滴加入至對應(yīng)的HEK293細(xì)胞孔中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 h，棄去轉(zhuǎn)染液，每孔加入2 mL 10%新生牛血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4.3 HEK293-rIL-7細(xì)胞亞克隆

轉(zhuǎn)染24 h后，吸除培養(yǎng)基，加入最小致死濃度的G418篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化，加入最小致死濃度的G418篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，按1個(gè)細(xì)胞/孔接種96孔板，每孔200 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)約14 d左右，觀察細(xì)胞克隆生長情況。

1.4.4 亞克隆細(xì)胞的初檢及其保存

96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，挑選1個(gè)細(xì)胞/孔的亞克隆細(xì)胞株，吸取150 μL培養(yǎng)基上清做ELISA檢測，具體檢測方法參見Abcam公司的IL-7 ELISA試劑盒(ab100574)。

將檢測為陽性的亞克隆細(xì)胞株從96孔板中依次放大至24孔板、6孔板及細(xì)胞瓶中，傳代過程中保證G418濃度不變，然后用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，取一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，其余細(xì)胞凍存。

1.5 亞克隆細(xì)胞株的IL-7表達(dá)檢測

1.5.1 熒光蛋白的表達(dá)情況

分別在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)以及對照組綠色熒光的表達(dá)情況，以初步判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.5.2 IL-7基因的轉(zhuǎn)錄

參照總RNA提取試劑盒(天根)提取HEK293-rIL-7細(xì)胞總RNA，TIANScript M-MLV的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。PCR方法同1.2。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.5.3 重組蛋白的ELISA檢測

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：向干粉中加入400 μL雙蒸水，溶解粉末，配置75 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液；然后取8 μL上述標(biāo)準(zhǔn)液，加入到592 μL的1×Assay Diluent B中，配置標(biāo)準(zhǔn)品1(1000 pg/mL)；再取200 μL上述標(biāo)準(zhǔn)液1，加入到400 μL的1×Assay Diluent B中，配置標(biāo)準(zhǔn)品2(333.3 pg/mL)；依次類推，分別配置標(biāo)準(zhǔn)品3(111.1 pg/mL)、標(biāo)準(zhǔn)品4(37 pg/mL)、標(biāo)準(zhǔn)品5(12.3 pg/mL)及標(biāo)準(zhǔn)品6(4.1 pg/mL)。

檢測方法參見Abcam公司的IL-7 ELISA試劑盒(ab100574)。

1.5.4 重組蛋白的Western Blotting分析

分別收集空白對照組及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞上清，經(jīng)凍干濃縮100倍后加入等量的2×SDS上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析，在15 V 30 min半干轉(zhuǎn)條件下轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。取出膜用50 g/L 脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h后，分別用1∶500的Mouse Anti-IL-7抗體4℃孵育過夜。次日，再加入1∶5000山羊抗鼠IgG-HRP，室溫?fù)u床反應(yīng)2 h。經(jīng)PBST充分洗滌后，進(jìn)行DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體 pcDNA3.1-rIL-7的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶(EcoR I +NotI)酶切后，出現(xiàn)2條清晰的電泳條帶，約為5.4 kb和540 bp，與預(yù)期相符(圖1)；測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，顯示插入片段與GenBank中公布的人IL-7基因(J04156.1)的核苷酸序列同源性為100%；表明重組表達(dá)載體pCDNA3.1-rIL-7構(gòu)建成功。

圖1 pCDNA3.1-rIL-7重組質(zhì)粒酶切鑒定

M: 1 kb plus DNA分子量Marker; 1～3: 重組質(zhì)粒pCDNA3.1-rIL-7雙酶切產(chǎn)物

2.2 G418最小致死濃度的篩選

加入不同濃度的G418培養(yǎng)14 d發(fā)現(xiàn)，G418濃度為600 μg/mL時(shí)，HEK293細(xì)胞全部死亡，所以HEK293細(xì)胞G418的最小致死量為600 μg/mL。

2.3 pcDNA3.1-rIL-7轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將pCDNA3.1-rIL-7與對照組pCDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，在24 h就可觀察到對照組出現(xiàn)綠色熒光，在48 h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，結(jié)果見圖2。說明pCDNA3.1-rIL-7成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。

2.4 HEK293-rIL-7細(xì)胞亞克隆及IL-7蛋白初檢

將HEK293-rIL-7細(xì)胞用含600 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基稀釋，按1cell/孔接種96孔板，培養(yǎng)2周，在第一周后觀察細(xì)胞，僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)單克隆細(xì)胞株，命名為2G3，用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清中有rIL-7蛋白表達(dá)。結(jié)果見表2。

圖2 HEK293-rIL-7細(xì)胞與對照組細(xì)胞綠色熒光觀察(100×)

A、C: pcDNA3.1-rIL-7轉(zhuǎn)染組24 h; B、D: pcDNA3.1-rIL-7轉(zhuǎn)染組48 h; E、G: pcDNA3.1-EGFP對照組轉(zhuǎn)染24 h; F、H: pcDNA3.1-EGFP對照組轉(zhuǎn)染48 h

表2 ELISA初檢結(jié)果

2.5 HEK293-rIL-7-2G3細(xì)胞株的IL-7表達(dá)檢測

2.5.1 IL-7基因的轉(zhuǎn)錄

HEK293-rIL-7-2G3的細(xì)胞可擴(kuò)增出IL-7基因片段(540 bp)，結(jié)果見圖3。說明IL-7基因在HEK293細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖3 HEK293-rIL-7-2G3細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測

M：100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：HEK293-rIL-7-2G3試驗(yàn)組；2：HEK293對照組

2.5.2 IL-7的ELISA檢測

將HEK293-rIL-7-2G3細(xì)胞在細(xì)胞瓶中培養(yǎng)2 d后，收取細(xì)胞上清，并用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線及IL-7含量計(jì)算公式見圖4；ELISA檢測結(jié)果見表3。

2.6 Western Blotting 檢測

收集各組細(xì)胞上清經(jīng)凍干濃縮100倍后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western Blotting分析。結(jié)果表明(圖5)，表達(dá)產(chǎn)物主要為分泌性表達(dá)，HEK293-rIL-7-2G3組在25 ku處出現(xiàn)特異性條帶，且HEK293-rIL-7-2G3濃縮樣品比非濃縮樣品組條帶粗很多，而HEK293上清及HEK293-EGFP上清組均無此條帶出現(xiàn)(圖5)，表明IL-7基因在HEK293細(xì)胞中得到正確表達(dá)，表達(dá)的重組IL-7蛋白能夠與鼠抗IL-7發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 IL-7標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

IL-7標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)光密度值樣品濃度光密度值樣品中IL-7的含量(ng/mL)10000.687333.30.24210-10.2763.2111.10.167370.114

圖5重組IL-7的Western Blotting分析

Fig 5 Western Blotting analysis of recombinant IL-7 protein

1: HEK293-rIL-7-2G3濃縮上清; 2: HEK293-EGFP對照濃縮上清；3: HEK293-rIL-7-2G3裂解細(xì)胞; 4: HEK293-EGFP裂解細(xì)胞; 5: HEK293空白上清;6: HEK293裂解細(xì)胞; M: 非預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

IL-7發(fā)現(xiàn)較早，但是對于其生物學(xué)功能研究近年來才開始，就目前來說，在相關(guān)分子機(jī)制上仍有所欠缺，且尚未形成產(chǎn)品(藥品)。大腸桿菌是使用最早的表達(dá)系統(tǒng)，它的顯著優(yōu)點(diǎn)是成本低，易于操作，產(chǎn)量高[16]，但是由于用大腸桿菌生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物缺乏糖基化在人體內(nèi)容易被降解，藥效因此大大降低。另外，它容易產(chǎn)生內(nèi)毒素和包涵體，這個(gè)問題也不容忽視。在外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)中酵母表達(dá)系統(tǒng)是后起之秀，原核細(xì)胞操作性良好，真核系統(tǒng)后加工能力也超強(qiáng)，缺點(diǎn)是產(chǎn)量低、糖基化問題較為突出[16]。昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)頗多，產(chǎn)品的免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)相似，水平也高，但是其表達(dá)產(chǎn)物的糖基化程度低，形式單一[17]；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后修飾，使產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能最接近天然蛋白質(zhì)[18]，常用的細(xì)胞株有CHO、SP2/0、BHK-21、Vero及HEK293等。李金松等[19]利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)通過FLP-In-CHO細(xì)胞表達(dá)人白細(xì)胞介素7，但因其使用的幾種細(xì)胞均為鼠源性，可能有微量的鼠IL-7難以去除，影響最終產(chǎn)品純度和質(zhì)量。為表達(dá)人用IL-7需排除鼠IL-7對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，故本研究選用HEK293細(xì)胞。

將真核表達(dá)載體pcDNA3.1-IL-7和對照組載體pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP對照組細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，證明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，熒光細(xì)胞的數(shù)量及熒光強(qiáng)度也在遞增，48 h后達(dá)到最強(qiáng)，但仍有部分細(xì)胞未發(fā)出熒光，說明有少部分細(xì)胞未轉(zhuǎn)染成功，需對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞亞克隆。對HEK293-rIL-7細(xì)胞亞克隆后，僅獲取了1株亞克隆細(xì)胞，經(jīng)ELISA初檢發(fā)現(xiàn)2G3中有IL-7的表達(dá)，將2G3放大培養(yǎng)，收集細(xì)胞沉淀及上清，通過Western Blotting及ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)，IL-7蛋白主要集中在細(xì)胞上清中，為分泌性表達(dá)，在75 cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)2 d后，檢測2G3培養(yǎng)基上清中IL-7的含量為3.2 ng/mL。

通過對比發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染組細(xì)胞IL-7的表達(dá)量要比慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)組的IL-7表達(dá)量高[20]，而且同一種方法中，HEK293-rIL-7的IL-7蛋白表達(dá)量要比CHO-K1-rIL-7的IL-7蛋白表達(dá)量高[21]，其中亞克隆細(xì)胞株2G3的IL-7蛋白表達(dá)量最高，達(dá)到3.2 ng/mL，本研究成功實(shí)現(xiàn)了IL-7蛋白在HEK293細(xì)胞中的分泌表達(dá)，但蛋白表達(dá)量相對較低，需對實(shí)驗(yàn)方法及細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，提高IL-7蛋白的表達(dá)水平。

[1]LUNDMARK F, DUVEFELT K, IACOBAEUS E, et al. Variation in interleukin 7 receptor α-chain (IL-7R) influences risk of multiple sclerosis[J]. Nat Genet, 2007, 39(9):1108-1113.

[2]丁 鵬, 劉永哲, 王貴強(qiáng), 等. 白細(xì)胞介素-7的生物學(xué)特征及其在臨床治療中的作用和意義[J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志, 2011, 3(4): 116-120.

[3]SUTHERLAND G R, BAKER E, FERNANDEZ K E, et al. The gene for human interleukin 7 (IL7) is at 8q12-13[J]. Hum Genet, 1989, 82(4):371-372.

[4]OUELLETTE T, DESTRAU S, OUELLETTE T, et al. Production and purification of refolded recombinant human IL-7 from inclusion bodies[J]. Protein Expres Purif, 2003, 30(2):156-166.

[5]彭羽瑜. 重組人白細(xì)胞介素-7及其剪接變異體蛋白的表達(dá)、復(fù)性和純化[D]. 廣州: 廣東藥學(xué)院, 2014.

[6]溫潔霞, 仲 飛, 李秀錦, 等. 白細(xì)胞介素7的生物學(xué)特性及其在抗病毒免疫中的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2012(S1): 98-102.

[7]SUN L, GUO J, BROWN R, et al. Declining expression of a single epithelial cell-autonomous gene accelerates age-related thymic involution[J]. Aging Cell, 2010, 9(3): 347-357.

[8]TANI-ICHI S, SHIMBA A, WAGATSUMA K, et al. Interleukin-7 receptor controls development and maturation of late stages of thymocyte subpopulations [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(2): 612-617.

[10]SIEG S F. Interleukin-7 biology in HIV disease and the path to immune reconstitution [J]. Curr HIV Res, 2012, 10 (4): 341-347.

[11]RONALD G. Improving the immune system with human IL-7 vaccine in older subjects who have had chemotherapy[EB/OL]. http://www.clinicaltrials.gov/ct2/ show/study/NCT01339000, 2016-06-16/2016-09-19.

[12]耿 梅, 陳 清, 徐麗慧, 等. 人白細(xì)胞介素7重組蛋白原核表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)和鑒定[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版), 2010, 31(4):331-335.

[13]婁瑞娟, 羅利龍, 張 霞, 等. 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展和前景展望[J]. 生物學(xué)雜志, 2010, 27(5): 73-76.

[14]唐元家, 余柏松. 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊, 2002, 23(6): 246-250.

[15]李志龍, 張富春. 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2006(6): 9-13.

[16]郭廣君, 呂素芳, 王榮富. 外源基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程, 2006, 6(5): 582-587.

[17]孫 陽, 張淑穎. 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究及其新進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 18(5): 96-99.

[18]RAI M, PADH H. Expression systems for production of heterologous proteins[J]. Curr Science, 2001, 80(9): 1121-1128.

[19]李金松, 麻粉蓮, 張 騫, 等. 人白細(xì)胞介素7在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及活性鑒定[J]. 生物技術(shù)通訊, 2015, 26(4): 477-480.

[20]李向茸, 令 瑛, 徐 雷, 等. 白細(xì)胞介素-7基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及在CHO-K1細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 2017, 30(6): 571-576.

[21]徐 雷. IL-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)[D]. 蘭州: 西北民族大學(xué), 2016.

Stable secretory expression of recombinant human IL-7 in HEK293 cells

LI Xiang-rong1,2, WANG Xing-long3, LING Ying3, XU Lei3, LI Qiong-yi3,ZHANG Hai-xia1,2, BAO Xiao-jing3, FENG Ruo-fei1,2

(1. The Key Bio-engineering and Technology Laboratory of Nationality Commission, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030; 2.Gansu Engineering Research Center for Animal Cell, Lanzhou 730030; 3. Life Science and Engineering College， Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China)

Q78

A

2095-1736(2017)05-0024-05

2016-08-22；

2016-09-18

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT13091)； 2015年中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(31920150075)；西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助研究生項(xiàng)目資助(Yxm2015205)

李向茸，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)和分子病毒學(xué)，E-mail：491753586@qq.com

馮若飛，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿硬《緦W(xué)，E-mail：frfself@126.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.024