申 璇, 袁久剛, 王 強(qiáng), 王 平, 范雪榮, 徐 進(jìn)

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

糖化改性對(duì)膠原蛋白乳化性能的影響

申 璇, 袁久剛, 王 強(qiáng), 王 平, 范雪榮, 徐 進(jìn)

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

為了提高膠原蛋白的穩(wěn)定性，并賦予其更多功能特性，通過美拉德反應(yīng)對(duì)膠原蛋白進(jìn)行了糖化改性。熒光光譜測試顯示乳糖與膠原蛋白間確實(shí)發(fā)生了美拉德反應(yīng)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。對(duì)其反應(yīng)條件的研究顯示：反應(yīng)時(shí)間的延長、溫度的提高、pH以及乳糖比例的提高，都有助于提高其反應(yīng)速度，最終導(dǎo)致產(chǎn)物褐變程度加深。經(jīng)過糖化改性后，膠原蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性得到改善，其水溶液中的膠束粒徑也增大。

膠原蛋白；α-乳糖；美拉德；熒光；乳化性

AbstractIn order to improve the stability and functional properties of collagen, a glycosylated product of collagen was prepared by Maillard reaction. The result of fluorescence spectra indicated that the Maillard reaction between the collagen and lactose occurred successfully. The fluorescence intensity was stronger with the longer reaction time. The studies on the reaction conditions showed that the reaction rate and the browning index of the products were increased with the increase of reaction time, temperature, pH and concentration of lactose. The emulsifying property of collagen was improved while the average micelle size in solutions increased after the glycosylation.

Keywordscollagen; α-lactose; Maillard reaction; fluorescence; emulsifying property

膠原蛋白廣泛存在于動(dòng)物的結(jié)締組織中，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此，膠原蛋白在化妝品、食品、醫(yī)藥、組織工程等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[1-3]。但是，膠原蛋白本身也存在很多缺點(diǎn)，例如：溶解性不好，易受蛋白酶水解，對(duì)熱、有機(jī)溶劑都不穩(wěn)定等，大大限制了其應(yīng)用。因此，為了提高膠原蛋白的穩(wěn)定性，并改善其功能特性，有必要對(duì)其進(jìn)行改性。

膠原蛋白可以采用磷酸化、酯化以及琥珀酰化等化學(xué)方法進(jìn)行改性，但是這些方法由于存在一定的化學(xué)品殘留問題，往往使改性產(chǎn)物的應(yīng)用受到限制。從20世紀(jì)80年代末開始，陸續(xù)有研究人員利用糖類物質(zhì)對(duì)蛋白進(jìn)行糖化改性，并取得了很好的效果[4-6]。這種改性方法主要是利用還原糖的末端羰基和蛋白質(zhì)上的氨基在簡單加熱條件下形成蛋白質(zhì)-糖共價(jià)化合物，該反應(yīng)又稱作“美拉德反應(yīng)”。由于該反應(yīng)具備條件簡單以及零化學(xué)添加的優(yōu)點(diǎn)，所以很快便成為蛋白質(zhì)材料改性領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。許多研究表明，通過美拉德反應(yīng)在蛋白中引入糖鏈后，蛋白質(zhì)的一些性質(zhì)如：溶解性[7]、乳化性[8]以及熱穩(wěn)定性[9]等，較改性之前均有了很大改善，同時(shí)還增加了許多蛋白本身不具有的性質(zhì)，如抗氧化性、抗菌性等[10-11]，而且改性后形成的蛋白-糖產(chǎn)物也不易被酶催化水解。因此，采用一些小分子的糖類物質(zhì)對(duì)膠原蛋白進(jìn)行糖化改性，可以有效改善膠原蛋白的性能，拓寬其應(yīng)用范圍。

本文以膠原蛋白為研究對(duì)象，采用濕熱法將乳糖接枝到膠原蛋白分子上，研究不同的反應(yīng)條件對(duì)接枝度和褐變程度的影響，并考察糖化改性對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)及性能的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

膠原蛋白(牛跟腱，BR級(jí)，上海寶曼生物科技有限公司)；α-乳糖(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純級(jí)別。

紫外可見分光光度計(jì)[WFZUE-2100，尤尼柯(上海)儀器有限公司]，熒光分光光度計(jì)(F-4600，日本Hitachi)，高速攪拌器(FA25，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)，激光粒度儀(ZS90，英國馬爾文公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖化膠原蛋白的制備

將膠原蛋白與乳糖按照一定比例溶解在pH為6～9的磷酸鹽緩沖溶液中，于漩渦振蕩儀上振蕩1 min，再放入恒溫振蕩水浴鍋中反應(yīng)一定時(shí)間(60℃～90℃，150 r/min)，反應(yīng)結(jié)束后放入冰箱迅速冷卻，于4℃去離子水中透析48 h，冷凍干燥制成粉末，置于冰箱中備用。

1.2.2 褐變程度的測定

[12-13]，取2.0 mL樣品液加入2.0 mL稀釋液，含10%(W/W)SDS及0.05 mol/L硼砂，以稀釋液作空白，在420 nm下測定吸光值D420 nm。

1.2.3 接枝度的測定

通過TNBS法測定膠原蛋白游離氨基數(shù)量的變化可以計(jì)算膠原蛋白與α-乳糖的接枝度[14]。取0.5 mL樣品液，加入到pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液中，再加入2 mL 0.05% 的TNBS試劑，于漩渦震蕩儀上振蕩1 min，之后在60 ℃水浴中避光反應(yīng)2 h，確保與游離氨基徹底反應(yīng)后立即放入冷水中進(jìn)行冷卻降溫，再于420 nm處測定吸光值。

接枝度按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

注：D0為未反應(yīng)時(shí)樣品的吸光值，Dt為反應(yīng)t時(shí)刻樣品的吸光值。

1.2.4 熒光光譜測試

采用F-4600熒光分光光度計(jì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測試。取3 mL樣品加入1 cm石英比色皿，設(shè)定激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為200～900 nm，掃描速率為12 000 nm/min，激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度均為5 nm[15]。

1.2.5 乳化性測定

按照Pearce和Kinsella[16]的方法進(jìn)行。取20 mL濃度為4 mg/mL的蛋白溶液(事先溶解在pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中)，加入5 mL的橄欖油，在10 000 r/min、室溫下攪拌5 min，分別在攪拌后0、10 min時(shí)從底部取100 μL。以0.1%(W/V)SDS稀釋100倍，測定500 nm處的吸光值D500 nm，以SDS溶液作空白。乳化活力指數(shù)EAI表示為：

式中：EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積(m2/g)；N是稀釋倍數(shù)；φ是體系中油相所占的分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)中油相占0.2；C是蛋白質(zhì)的濃度(g/mL)；L是比色池光徑(1 cm)。

乳化穩(wěn)定性(ES)用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)表示：

式中：D0為0時(shí)刻的吸光值；Dt為t時(shí)刻的吸光值；△T為時(shí)間差；△D為△T內(nèi)的吸光值差。

1.2.6 粒徑分布測定

接枝物溶液的粒徑分布采用激光粒度儀測定。將反應(yīng)液稀釋一定倍數(shù)后放入樣品池中進(jìn)行測量，掃描范圍0.1～10 000 nm，粒徑分布由儀器自帶的軟件自動(dòng)計(jì)算得出。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜分析

在美拉德反應(yīng)過程中，會(huì)產(chǎn)生一些小分子的熒光物質(zhì)，其典型光譜特征為激發(fā)波長340～370 nm，發(fā)射波長在420～440 nm[17]，將樣品在激發(fā)波長360 nm下進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 膠原蛋白與糖化膠原蛋白的熒光光譜圖

由圖1可以看出，乳糖與膠原蛋白之間的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在發(fā)射波長為460 nm處有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，反應(yīng)0.5 h后，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度顯著增加，而且隨著時(shí)間的增長，膠原蛋白與乳糖之間的美拉德反應(yīng)程度越來越高，因此產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度也越來越大。

2.2 不同反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物褐變程度和接枝度的影響

膠原蛋白與乳糖間的美拉德反應(yīng)主要是蛋白分子中的自由氨基與還原糖末端羰基之間發(fā)生的羰氨反應(yīng)，因此，可以通過測定反應(yīng)過程中自由氨基含量的變化來間接確定反應(yīng)的接枝度。另外，美拉德反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生一定的顏色變化——褐變，這是美拉德反應(yīng)中最顯著的特征，反應(yīng)程度越大，顏色越深，因此也可通過褐變程度來確定反應(yīng)程度。

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，產(chǎn)物溶液褐變程度和接枝度均逐漸增加。在反應(yīng)初期，膠原蛋白由于肽鏈間的疏水作用，蛋白質(zhì)大分子不能完全舒展，自由氨基在初始階段暴露程度較低，所以其褐變程度較低；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸展開，因此，越來越多的自由氨基暴露并參與到反應(yīng)中，導(dǎo)致反應(yīng)速率加快，褐變程度迅速提高[18]，接枝度也逐漸增大。

圖2 時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度和接枝度的影響(pH 7.0，80℃)

2.2.2 反應(yīng)溫度的影響

由圖3可以看出，溫度對(duì)美拉德反應(yīng)有重要影響。隨著反應(yīng)溫度的升高，產(chǎn)物的褐變程度逐漸加深，而接枝度則呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，褐變程度較低，而溫度高于80℃時(shí)，褐變程度迅速加劇，接枝度則有所下降。這可能是由于溫度較高時(shí)，美拉德反應(yīng)會(huì)迅速進(jìn)入高級(jí)階段，膠原蛋白會(huì)發(fā)生一定程度的交聯(lián)，同時(shí)引入的糖分子也會(huì)使蛋白的溶解性能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)測得的接枝度反而降低。

2.2.3 pH的影響

濕法美拉德反應(yīng)通常在一定的緩沖體系中進(jìn)行。大量研究表明，pH對(duì)美拉德反應(yīng)有很大影響。從圖4可以看出，在pH 8.2左右時(shí)，接枝度及褐變程度都較低，這是因?yàn)榕８炷z原蛋白的等電點(diǎn)在7.5～7.8附近，此時(shí)其溶解性較差，因此反應(yīng)性能也較低；與酸性條件相比，在堿性條件下，乳糖與膠原蛋白間的美拉德反應(yīng)較快，有大量的類黑色物質(zhì)生成，褐變增加較快。這是因?yàn)橄驂A的形成屬于親核反應(yīng)，在弱酸性條件下，膠原蛋白上的氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，兩者之間不容易形成復(fù)合物，而且形成的羰胺縮合產(chǎn)物也容易水解，所以反應(yīng)不易進(jìn)行。

圖3 溫度對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度和接枝度的影響(pH 7.0， 2 h)

圖4 pH對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度和接枝度的影響(80℃，2 h)

2.2.4 蛋白與糖比例的影響

從圖5可以看出，隨著乳糖用量的逐漸增加，產(chǎn)物的褐變程度逐漸增加，而接枝度則呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在膠原蛋白與乳糖反應(yīng)比為1∶2時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于糖用量的增加提高了蛋白質(zhì)自由氨基與乳糖分子上羰基之間的接觸概率，促進(jìn)了大量的席夫堿生成，而這一步則是整個(gè)美拉德反應(yīng)的決速步驟，大量的席夫堿又可以促進(jìn)兩者之間的反應(yīng)迅速從早期階段進(jìn)行到下一階段，最終導(dǎo)致褐變程度及接枝度均快速增加。然而，隨著糖用量的繼續(xù)增加，接枝度降低，這可能是由于乳糖含量的增加使得溶液黏度上升，流動(dòng)性變差，不利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行[19]。

2.3 乳化性能的變化

蛋白質(zhì)本身是一種表面活性劑，能夠降低油-水界面張力，從而促使乳狀液的形成，并且它能在油滴周圍形成蛋白質(zhì)界面層，阻止脂肪滴的聚結(jié)和分層[20-22]。由圖6可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，糖化膠原蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性均有一定程度的改善，在膠原蛋白與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，蛋白質(zhì)分子展開，隱藏在內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來，產(chǎn)物更易于分散在油-水界面，同時(shí)乳糖的加入能增加油-水體系中水相的黏度，使油-水界面張力略有下降，因而乳化穩(wěn)定性也有一定的改善。

圖5 蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)美拉德反應(yīng)褐變程度和接枝度的影響(pH 7.0,80℃，2 h)

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖化膠原蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

2.4 改性產(chǎn)物的粒徑分布

膠原蛋白的聚集程度在一定程度上可以由粒徑分布和膠原蛋白溶液在313 nm下的吸光度來表征[23]，對(duì)其分別進(jìn)行測試，結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白溶液粒徑分布的影響

由圖7可以看出，膠原蛋白與乳糖反應(yīng)后，其粒徑分布向粒度大的方向偏移；而由圖8可以看出，未改性膠原蛋白在λ313 nm處的吸收值沒有明顯增加，而美拉德產(chǎn)物在λ313 nm處的吸光度則有一定的增加，這表明乳糖的引入使得膠原蛋白在溶液中產(chǎn)生了一定的可溶性聚集體[24]。這是由于膠原蛋白與乳糖發(fā)生反應(yīng)后，其肽鏈變得更為舒展，分子內(nèi)部原有的一些疏水性芳香族和脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露，導(dǎo)致其表面疏水性增加，暴露的疏水性基團(tuán)相互作用生成膠束粒徑更大的聚集體，但是由于乳糖的存在，這些聚集體并未發(fā)生絮凝。

圖8 膠原蛋白和美拉德產(chǎn)物溶液聚集動(dòng)力學(xué)曲線

3 結(jié)論

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，利用美拉德反應(yīng)，可以非常容易地實(shí)現(xiàn)膠原蛋白的糖化改性。反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH和底物配比均會(huì)對(duì)接枝反應(yīng)產(chǎn)生影響，同時(shí)反應(yīng)中也會(huì)不斷產(chǎn)生熒光物質(zhì)。對(duì)改性后糖化膠原蛋白產(chǎn)物的性能測試表明，膠原蛋白的乳化性能有一定程度的改善，其溶液中蛋白的平均粒徑分布也變大，這都有助于改善膠原蛋白的功能性，提高其在化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用性能。

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Effects of glycosylated modification on emulsifying properties of collagen

SHEN Xuan, YUAN Jiu-gang, WANG Qiang, WANG Ping, FAN Xue-rong, XU Jin

(Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122， China)

Q816

A

2095-1736(2017)05-0020-04

2016-09-18;

2016-09-30

國家自然科學(xué)基金(31300785)；中國博士后科學(xué)基金(2015M581721)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

申 璇，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榧徔椛锛夹g(shù)，E-mail:sxjndx@163.com

袁久剛，副教授，博士，主要從事紡織品生物加工技術(shù)研究， E-mail: jiugangyuan@163.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.020