韓丙軍，黃海珠，何燕，林冰，陳麗霞

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質量安全重點實驗室，海南?？?71101；2.瓊臺師范學院數(shù)理系，海南?？?71100）

UPLC-MS/MS測定動物源食品中4種農(nóng)藥殘留

韓丙軍1，黃海珠1，何燕1，林冰1，陳麗霞2，*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質量安全重點實驗室，海南海口571101；2.瓊臺師范學院數(shù)理系，海南?？?71100）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）同時測定動物源食品中的4種新型農(nóng)藥氯蟲苯甲酰胺、螺螨酯、聯(lián)苯三唑醇和噻菌靈殘留的方法。樣品通過乙腈提取，采用改進的QuEChERS方法進行凈化，經(jīng)C18超高效液相柱分離后，使用電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應離子監(jiān)測模式定性分析，基質匹配標準曲線外標法定量。結果表明，氯蟲苯甲酰胺、螺螨酯、聯(lián)苯三唑醇和噻菌靈的定量限（10倍信噪比）分別為0.30、3.00、0.50、0.10 μg/kg；在0.005 mg/L～0.200 mg/L濃度范圍內，4種農(nóng)藥的線性相關系數(shù)均大于0.999；在0.005、0.050、0.200 mg/kg添加水平范圍內，牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋樣品的平均添加回收率在82%～109%之間，相對標準偏差在2.1%～8.5%之間（n=5）。該方法簡單、快速，靈敏度及準確度高，能夠滿足動物源食品中4種農(nóng)藥殘留量的檢測要求。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜；氯蟲苯甲酰胺；螺螨酯；聯(lián)苯三唑醇；噻菌靈；動物源食品

Abstract：To determine the residues of chlorantraniliprole，spirodiclofen，bitertanol and thiabendazole in food products of animal origin，a method was established by using ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry.With acetonitrile as the extraction solvent，a modified QuEChERS method was chosen to purified the analytes from the food sample.The target compounds were separated by a C18 UPLC column，then detected by electro-spray ionization（ESI+）and multiple reaction monitoring（MRM）mode.Quantification was performed by peak area external standard methods using matrix-matched calibration curves，which were linear in the range of 0.005 mg/L-0.200 mg/L with good linear relationships.The correlation coefficients were better than 0.999.The limit of quantification （LOQ）of chlorantraniliprole，spirodiclofen，bitertanol and thiabendazole was 0.30，3.00，0.50，0.10 μg/kg respectively.At 0.005，0.050 ，0.200 mg/kg spiked levels for milk，pork，liver and egg samples，the recoveries were between 82%and 109%，and the relative standard deviations（RSD）were in range of 2.1%to 8.5%（n=5）.This method was simple，quick，accurate，and could be applied to the determination of the four pesticides residues in food products of animal origin.

Key words：ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；chlorantraniliprole；spirodiclofen；bitertanol；thiabendazole；food products of animal origin

動物源食品是人民日常生活消費的重要組成部分，主要包括各種可食用的動物組織以及蛋和奶等[1-2]。隨著人民生活水平的提高，動物源食品在人們生活水平中的比重日益增大，動物源食品安全問題成為全社會關注的焦點。在影響食品質量安全的眾多因素中，農(nóng)藥殘留主要的原因之一，農(nóng)藥在果蔬、糧食等作物生產(chǎn)加工中使用以后，其殘留可能經(jīng)食物鏈傳遞而進入到動物源食品中，進而影響人體健康。因此，開發(fā)動物源食品中農(nóng)藥殘留分析方法，對評價其在動物源食品中的殘留檢測及安全性評價均具有重要的意義。

近年來，各種新型農(nóng)藥不斷的研制成功，并被廣泛的應用于替代傳統(tǒng)高毒高殘留農(nóng)藥。如杜邦公司2008年成功研發(fā)氯蟲苯甲酰胺，被認為顛覆了傳統(tǒng)殺蟲劑的概念[3]，對鱗翅目及煙粉虱等多種非鱗翅目害蟲均有較好的防效[4-5]。但是，隨著這些新型農(nóng)藥的廣泛應用，其殘留問題可能給農(nóng)產(chǎn)品帶來安全隱患。開發(fā)這些農(nóng)藥的分析研究方法可為其市場監(jiān)測提供必要的手段，進而為制定其最大殘留限量提供檢測依據(jù)。

液質聯(lián)用技術在動物源食品中農(nóng)獸藥殘留的測定得到了廣泛的應用，但是其應用主要集中在傳統(tǒng)的獸藥和激素當中[6-7]，而關于動物源食品中新型農(nóng)藥殘留分析方法的研究較少[8]。因此，本試驗選擇4種新型農(nóng)藥氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）[9-10]、螺螨酯（spirodiclofen）[11-12]、聯(lián)苯三唑醇（bitertanol）[13-14]和噻菌靈（thiabendazole）[15-16]作為研究對象，研究使用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定其在牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋等動物源食品中的殘留量的方法，為4種新型農(nóng)藥在動物源食品中殘留量的測定提供技術依據(jù)。4種農(nóng)藥的分子結構式見圖1。

圖1 4種農(nóng)藥的分子結構式Fig.1 Chemical structures of four pesticides

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（UPLC-MS/MS）：Shimadzu；LC-30AD超高效液相色譜儀：日本島津公司；AB Qtrap 5500質譜系統(tǒng)：美國AB SCIEX公司。ULTRA-TURRAX T25 digital高速勻漿機：IKA公司；GL-10C高速離心機：上海安亭科學儀器廠；R206旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

1.1.2 試劑和材料

本試驗中所用水均為超純水。氯蟲苯甲酰胺、螺螨酯、聯(lián)苯三唑醇和噻菌靈4種農(nóng)藥標準品：德國Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈（色譜純）：Fisher試劑公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）：廣州化學試劑廠；PSA吸附劑（乙二胺-N-丙基硅烷，分析純）：ANPEL儀器（上海）有限公司。

牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋均為市售，其中豬肉去骨和皮、雞蛋去殼后取全蛋全部粉碎，充分混合放入食品加工器粉碎，制成待測樣。

1.1.3 提取和凈化

試驗使用改進的QuEChERS方法對4種目標物進行提取和凈化。稱取動物源樣品（10.0±0.2）g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，高速勻漿2 min。加入1.5 g氯化鈉，蝸旋劇烈震蕩1 min后，以4 000 r/min的轉速離心5 min，分取上清液5 mL用于凈化處理。

試驗選擇無水硫酸鎂、PSA和C18吸附劑作為凈化材料對提取液進行凈化，分別各加入100 mg凈化材料，蝸旋劇烈震蕩1 min后，以4 000 r/min的轉速離心5 min，取下層乙腈相提取液2 mL，濃縮定容至1 mL后經(jīng)0.22 μm微膜過濾，使用UPLC-MS/MS進行測定。

1.1.4 儀器分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；柱溫：25℃。流速：0.30 mL/min；進樣量：10 μL。流動相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水；梯度洗脫條件為：0～1.0 min，10%A 變?yōu)?60%A；1.00 min～3.00 min，60%A 變?yōu)?75%A；3.00 min～3.30 min，保持 75%A；3.30 min～3.50 min，75%A 變?yōu)?0%A；最后流動相保持10%A至4.00 min停止。

掃描方式：電噴霧正離子（ESI+）掃描；霧化氣：379.225 kPa；噴霧電壓：5 000 kV；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）。定性、定量離子對及去簇電壓、碰撞電壓見表1。

表1 4種農(nóng)藥的主要質譜參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters of four pesticides

2 結果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

QuEChERS凈化方法具有快速、簡便和高效等特點，近年來已經(jīng)被廣泛的各類食品中農(nóng)藥殘留的前處理。本試驗發(fā)現(xiàn)乙腈對動物源中的4種農(nóng)藥具有較好的提取效率，但是由于動物源樣品中通常含有較多的脂肪、蛋白質等雜質，在使用QuEChERS方法進行前處理時樣品上機液凈化效果較差，容易引起儀器污染。因此，本試驗中對QuEChERS方法進行改進，在使用無水硫酸鎂和PSA吸附劑進行凈化的同時加入C18粉末協(xié)助凈化，取得較好的凈化效果，樣品上機液清亮，同時可以很好的保證4種農(nóng)藥的提取效率。試驗同時使用了C18固相萃取小柱對樣品進行凈化，并改進的QuEChERS方法進行對比，結果發(fā)現(xiàn)兩者都具有較好的凈化效果，但是萃取小柱凈化耗時更長，并且在洗脫液體積不足時，容易出現(xiàn)回收率偏低的現(xiàn)象。因此，為了提高分析效率，本試驗采用C18協(xié)助無水硫酸鎂和PSA吸附劑進行凈化的方案。

2.2 色譜條件優(yōu)化

使用串聯(lián)質譜儀作為超高壓液相色譜的檢測器，可以通過提取定量/定性離子對的模式實現(xiàn)分析目標物的多通道檢測。因此，在試驗中色譜分離時重點調整流動相的組成與比例，從而保證分析目標物的良好峰形及較快的出峰時間。試驗采用常規(guī)C18超高壓液相色譜柱，實現(xiàn)了4種農(nóng)藥的良好分離。加入適量的甲酸可以提高目標物的離子化效率，因此，在流動相中加入0.1%甲酸，同時可適當?shù)母纳品逍?。?jīng)過反復試驗，調整不同時間段流動相中乙腈和0.1%甲酸水的不同比例，以梯度洗脫的方式，確定了最佳梯度洗脫條件，實現(xiàn)4種農(nóng)藥的快速分離和檢測。經(jīng)過色譜分離后4種農(nóng)藥的保留時間見表1，典型色譜圖見圖2。

從圖2可以看出，在試驗所設定的質譜和超高效液相色譜條件下，通過選擇多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring mode，MRM），4 種農(nóng)藥可以實現(xiàn)在3 min內的快速測定，并通過提取離子的模式得到良好的分離。

圖2 4種農(nóng)藥的典型色譜圖Fig.2 Typical total ion chromatograms of the four pesticides

2.3 質譜條件優(yōu)化

試驗采用1.0 mg/L的4種農(nóng)藥的單標溶液在正離子模式下進行全掃描，確定其分子離子，并對儀器碎裂電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化得到的質譜參數(shù)見表1。在一級質譜中，各農(nóng)藥組分均產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+分子離子。母離子進入二級質譜，發(fā)生斷裂或重排等反應產(chǎn)生不同的離子碎片，通過對分子離子進行二級質譜全掃描，選擇信號強度較大的兩個碎片離子為定性離子對（見表1），并選擇信號強度最大的離子作為定量離子對，用于農(nóng)藥的定量檢測分析。此外，為了降低樣品基質效應可能對目標物離子化帶來的干擾，在樣品分析時需要使用對應基質提取液配制標準品。

2.4 線性范圍和檢出限

在本方法所確定的試驗條件下，使用逐級稀釋法分別配制 0.005、0.010、0.050、0.100、0.200 mg/L 的 4 種農(nóng)藥的系列標準溶液，采用外標法進行定量，試驗結果見表2。

表2 4種農(nóng)藥的線性回歸方程、檢出限和定量限Table 2 Standard curve，LOD and LOQ of four pesticides

以4種農(nóng)藥標準溶液濃度（Y）與監(jiān)測定量離子的響應峰面積（X）繪制標準曲線，4種農(nóng)藥線性回歸方程的相關系數(shù)均大于0.999，方法具有良好的線性；同時分別以定量離子響應的3倍和10倍信噪比對應峰高的質量分數(shù)作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種農(nóng)藥的定量限分別為 0.30、3.0、0.50、0.10 μg/kg。目前我國尚未制定動物源食品中4種農(nóng)藥的最大殘留限量（MRL），CAC已制定4種農(nóng)藥在各種動物源及植物源食品中的MRL，氯蟲苯甲酰胺、螺螨酯、聯(lián)苯三唑醇和噻菌靈4種農(nóng)藥在動物源食品中的MRL最小值分別為 10、4、10、5 μg/kg，本方法均可滿足其檢測分析的需求。

2.5 回收率與精密度

分別以不含4種農(nóng)藥的牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋作為空白樣品，進行0.005、0.050、0.200 mg/kg 3個水平的添加回收試驗，每個處理重復5次，用上述分析方法測定回收率，結果見表3。

表3 4種農(nóng)藥的添加回收率及相對標準偏差（n=5）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSD）of four pesticides（n=5）

由表3可以看出，在0.005 mg/kg～0.200 mg/kg的添加濃度范圍內，牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋樣品的平均添加回收率在82%～109%之間，相對標準偏差在2.1%～8.5%之間，均符合農(nóng)藥殘留測定允許范圍，說明該方法的準確度和精密度符合殘留檢測要求。

2.6 實際樣品的檢測

為了驗證方法在實際樣品分析中的適用性，試驗在?？诒镜厥袌龇謩e采集牛奶、豬肉、豬肝和雞蛋樣品各30個，使用本方法檢測樣品中4種農(nóng)藥的殘留量，檢測結果均為未檢出。方法具有良好的靈敏度和的重現(xiàn)性，可用于滿足市場樣品監(jiān)測的需求。

3 討論與結論

本研究使用乙腈高速勻漿提取，改進的QuECh-ERS方法進行凈化，通過串聯(lián)質譜法同時測定動物源食品中的4種新型農(nóng)藥氯蟲苯甲酰胺、螺螨酯、聯(lián)苯三唑醇和噻菌靈殘留量。該方法準確、快捷、穩(wěn)定、靈敏度及準確度高，適用于動物源食品中上述4種農(nóng)藥殘留的檢測分析。

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Determination of Four Pesticides Residues in Food Products of Animal Origin Using Ultra-high Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

HAN Bing-jun1，HUANG Hai-zhu1，HE Yan1，LIN Bing1，CHEN Li-xia2，*
（1.Analysis&Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，Haikou 571101，Hainan，China；2.Mathematical Department，Qiongtai Teachers College，Haikou 571100，Hainan，China）

2017-03-02

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.027

海南省應用技術研發(fā)與示范推廣專項（ZDXM2015044）；海南自然科學基金面上項目（20163078）；海南省高等學?？茖W研究項目（Hnky2016ZD-14）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項資金（1630082017005）

韓丙軍（1982—），男（漢），副研究員，博士，主要從事農(nóng)藥殘留分析與研究。

*通信作者：陳麗霞，女，副教授，研究方向：生物食品安全。