胡彬，柴程，戰(zhàn)虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

酶法降解米糠中植酸的工藝研究

胡彬，柴程，戰(zhàn)虎

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通過酶法降解米糠中植酸，植酸酶能將植酸及其二價(jià)鹽類菲丁水解生成肌醇。以酶用量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度為影響因素，以代謝產(chǎn)物肌醇含量為判定依據(jù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)以得出較優(yōu)組合。通過試驗(yàn)得出四因素對(duì)植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影響大小順序?yàn)椋好赣昧浚緋H值＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度，植酸最佳酶解條件為酶用量60 U/g，反應(yīng)時(shí)間20 min，pH值4.0，反應(yīng)溫度55℃。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得肌醇含量為66.21 mg。酶解法反應(yīng)條件溫和、耗能低，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種新的思路。

米糠；植酸；肌醇；酶解

Abstract：Degradation of phytic acid in rice bran by enzymatic method，phytase can form phytic acid and its divalent salt phenanthroline to produce inositol.The effects of enzyme dosage，enzymolysis time，pH value and enzymolysis temperature were studied，single factor test and orthogonal test were used to determine the optimal combination of the inositol content of the metabolites.The results showed that the effect of four factors on the phytase content of phytase was enzyme dosage＞pH＞ reaction time＞ reaction temperature，the phytase optimum conditions for the amount of enzyme 60 U/g，reaction time 20 min，pH value of 4.0，reaction temperature 55℃.Verifying test the inositol content was 66.21 mg.Enzymatic hydrolysis has mild reaction conditions，low energy consumption，for the industrial production provides a new idea.

Key words：rice bran；phytic acid；inositol；enzymolysis

米糠是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的油料資源。米糠中除米糠油、米糠蛋白外，還富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分。米糠中植酸及其二價(jià)鹽類菲丁物質(zhì)的含量可達(dá)11%左右[1]。以植酸及其二價(jià)鹽類菲丁為主要底物，利用微生物產(chǎn)生的植酸酶和磷酸酯酶來生產(chǎn)肌醇[2]，是未來米糠中植酸類物質(zhì)應(yīng)用趨勢(shì)。這是在一系列復(fù)雜的調(diào)控中非常精巧地將植酸或菲丁在酶的作用下轉(zhuǎn)化為肌醇。由于酶的反應(yīng)條件比較溫和，此法制取肌醇可在常溫常壓下進(jìn)行，且不會(huì)造成污染。肌醇生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)模和數(shù)量，都有不斷增長的趨勢(shì)，這便對(duì)肌醇的生產(chǎn)工藝提出了新的更高的要求。目前研究熱點(diǎn)是微生物酶解法和化學(xué)合成法[3]，化學(xué)合成法在國內(nèi)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但酶解法在國內(nèi)仍處于研究階段，具有廣闊應(yīng)用前景，是今后肌醇生產(chǎn)發(fā)展方向[4]。本試驗(yàn)所采用酶解法反應(yīng)條件溫和、耗能低，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種新的思路。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

米糠：市售；植酸酶（活力3萬U/g）：天津一方科技有限公司；硫代硫酸鈉溶液 [標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)：GBW（E）081235；批號(hào)：160613]、重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液[標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)：GBW（E）080497；批號(hào)：160601]：上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院；其它化學(xué)試劑均為分析純：天津一方科技有限公司。

1.2 設(shè)備

XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；DHG-電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C數(shù)字PH計(jì)：天津市盛邦科學(xué)儀器技術(shù)公司；T-500型電子天平：常熟雙杰測(cè)試儀器廠；720分光光度計(jì)：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S恒溫磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠。

2 方法

2.1 米糠植酸溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100 g米糠于燒杯中，以米糠∶水（質(zhì)量比）=1∶8的比例加水，用鹽酸調(diào)pH值為3.0，在28℃下攪拌浸泡6 h后進(jìn)行離心分離（2 000 r/min，15 min），抽濾，將離心后殘?jiān)们逅礈煸俅纬闉V，兩次濾液合并得到植酸提取液，經(jīng)717型陰離子交換樹脂除雜得到植酸鈉洗提液，定容至500 mL，為米糠植酸溶液。經(jīng)測(cè)得，該溶液中植酸含量為0.008 6 g/mL。

2.2 酶解試驗(yàn)

取植酸稀溶液于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)底物植酸的pH值，然后加入植酸酶溶液，水浴加熱，水解一定時(shí)間后測(cè)量水解液中肌醇含量。以肌醇含量為指標(biāo)探究加酶量、時(shí)間、pH、溫度等因素對(duì)植酸酶酶解的影響。

2.3 肌醇含量的測(cè)定方法[5]

肌醇為環(huán)已六醇，在強(qiáng)酸性溶液中，用重鉻酸鉀氧化生成二氧化碳和水，其反應(yīng)如下：

使用過量的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液氧化濾液中的肌醇，過量的重鉻酸鉀氧化碘化鉀。使碘離子游離生成游離碘，然后用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。其反應(yīng)如下：

酶解完成后，立即取出并放入煮沸的沸水中，使酶失活。冷卻至室溫后，抽濾，除去不溶物，收集濾液。并記錄濾液體積。取濾液8 mL濾液于250 mL的碘量瓶中，加入2 mL標(biāo)定的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 mL 20%的稀硫酸溶液，于80℃水浴加熱3 h，冷卻至室溫后加入4 mL10%碘化鉀溶液，水封后置于暗處反應(yīng)15 min，然后加入約20 mL蒸餾水，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至近終點(diǎn)時(shí)，即溶液顯黃綠色，加入0.5%淀粉溶液10滴，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積。按下式計(jì)算肌醇含量。

式中：m為肌醇含量，mg；c1為K2Cr2O7溶液濃度，mol/mL；v1為 K2Cr2O7溶液體積，mL；c2為 Na2S2O3溶液濃度，mol/mL；v2為 Na2S2O3溶液體積，mL。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 酶用量對(duì)肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH 值到 5.5，分別加入活性 0、30、60、90、120、150 U/g的植酸酶，在55℃水浴加熱10 min，立即取出并經(jīng)100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測(cè)定濾液中肌醇含量。

2.4.2 時(shí)間對(duì)肌醇含量的影響

取20mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，55℃水浴加熱分別加熱 5、10、15、20、25、30 min，立即取出并經(jīng) 100 ℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測(cè)定濾液中肌醇含量。

2.4.3 pH值對(duì)肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié) pH 值到 2、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.5、6、6.5，加入 30 U/g的植酸酶，55℃水浴加熱分別加熱25 min，立即取出并經(jīng)100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測(cè)定濾液中肌醇含量。

2.4.4 溫度對(duì)肌醇含量的影響

取20 mL植酸稀溶液（植酸含量為0.008 6 g/mL）于50 mL燒杯中，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值到5.5，加入30 U/g的植酸酶，分別在35、45、55、65、75℃下水浴加熱25 min，立即取出并經(jīng)100℃沸水加熱使酶失活，通過抽濾，除去不溶物，測(cè)定濾液中肌醇含量。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素研究的水平上，設(shè)計(jì)了以酶用量、時(shí)間、pH值、溫度為自變量，以所得的肌醇含量作為四因素三水平的正交試驗(yàn)。正交因素水平如表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Factor and levels of orthogonal experiment

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 酶用量對(duì)肌醇含量的影響

酶用量對(duì)肌醇含量的影響見圖1。

圖1 酶用量對(duì)肌醇含量的影響Fig.1 Effect of the amount of enzyme on inositol

由圖1可以看出，當(dāng)酶用量小于60 U/g時(shí)，肌醇含量隨著酶用量的增加而增加。但是當(dāng)酶用量大于60 U/g之后，肌醇含量增加不明顯?？赡苁且?yàn)槊赣昧窟_(dá)到60 U/g時(shí)反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，繼續(xù)增加酶用量，并不能促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。而且酶用量的增加，會(huì)促使產(chǎn)品成本的增加。因此，選擇酶用量為60 U/g最宜。

3.1.2 時(shí)間對(duì)肌醇含量的影響

時(shí)間對(duì)肌醇含量的影響見圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)肌醇含量的影響Fig.2 Effect of time on inositol

由圖2可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間小于25 min時(shí)，肌醇含量隨著酶解時(shí)間的增加而增加，但是當(dāng)酶解時(shí)間大于25 min時(shí)，肌醇含量趨于平衡，不但沒有增加，反而有減小的趨勢(shì)?？赡芙到?5 min后，反應(yīng)已達(dá)到平衡，增加酶解時(shí)間并不能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。增加酶解時(shí)間必然會(huì)增加產(chǎn)品的成本，本試驗(yàn)采取的酶解時(shí)間為25 min。但是由于時(shí)間拐點(diǎn)并不明顯，因此在今后的試驗(yàn)中應(yīng)繼續(xù)延長時(shí)間，再測(cè)定肌醇含量。

3.1.3 pH值對(duì)肌醇含量的影響

pH值對(duì)肌醇含量的影響見圖3。

由圖3可以看出，當(dāng)pH值大于2.5時(shí)，肌醇含量隨pH值的升高而升高，但肌醇含量小于pH值為5.5時(shí)的肌醇含量。當(dāng)pH值小于5.5時(shí)，肌醇含量隨著pH值得升高而逐漸升高，當(dāng)pH值大于5.5時(shí)，肌醇含量隨著pH值得升高而減少。主要是因?yàn)閜H值過低不能使植酸酶達(dá)到最大活性；pH值過高植酸酶則可能失活，二者都不能使植酸酶最大發(fā)揮活性，致使效果不佳。因此，本試驗(yàn)采用的pH值為5.5。

圖3 pH值對(duì)肌醇含量的影響Fig.3 Effect of pH value on inositol

3.1.4 溫度對(duì)肌醇含量的影響

溫度對(duì)肌醇含量的影響見圖4。

圖4 溫度對(duì)肌醇含量的影響Fig.4 Effect of temperature on inositol

由圖4可以看出，當(dāng)溫度小于55℃時(shí)，肌醇含量隨著溫度的升高而升高，但當(dāng)溫度大于55℃時(shí)，肌醇含量隨著溫度的升高而減少。主要是因?yàn)楫?dāng)溫度較低時(shí)，植酸酶未能充分發(fā)揮其活性，酶解反應(yīng)不完全，得到的肌醇含量少。當(dāng)溫度較高時(shí)，植酸酶活性被抑制，致使酶解效果不佳。因此，本試驗(yàn)采用的酶解溫度為55℃。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，依據(jù)研究目的要求，選取酶用量、時(shí)間、pH值、溫度4個(gè)因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)及優(yōu)化酶解工藝。試驗(yàn)結(jié)果及分析如表2、表3所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Continue table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由正交試驗(yàn)中極差R得知，四因素對(duì)本試驗(yàn)影響大小順序?yàn)椋好赣昧浚緋H值＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。而由均值1、均值2、均值3值得出的最佳組合為A2B1C1D2。驗(yàn)證試驗(yàn)所得肌醇含量為66.21 mg，高于第6組試驗(yàn)結(jié)果，故選取酶用量60 U/g，反應(yīng)時(shí)間20 min，pH值4.0，反應(yīng)溫度55℃，作為最佳媒介條件。由方差分析表可以看出，誤差為10.28，是由于植酸酶品種差異造成及人為操作不當(dāng)造成的。

4 結(jié)論

根據(jù)本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論：對(duì)植酸酶酶解植酸所得的肌醇含量的影響大小順序?yàn)椋好赣昧浚緋H值＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。這4個(gè)條件對(duì)提高肌醇產(chǎn)量時(shí)的最佳組合即最佳條件為酶用量60 U/g，反應(yīng)時(shí)間20 min，pH 4.0，反應(yīng)溫度55℃，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)得出肌醇含量達(dá)66.21 mg。目前，肌醇的生產(chǎn)方法主要是通過化學(xué)方法完成的，這些方法的最大缺點(diǎn)是能耗較高、污染較大、剩余的廢渣不能綜合利用，這與化學(xué)工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)相背離?，F(xiàn)代化學(xué)工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)是環(huán)境友好、綠色化學(xué)、可持續(xù)發(fā)展，要求生產(chǎn)體系在贏得經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，不對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅；盡可能少地消耗不可再生的資源；還要降低或消除有有害物質(zhì)的使用和生成的化學(xué)產(chǎn)品和制造工藝。

生物催化為實(shí)現(xiàn)綠色化學(xué)的目標(biāo)提供了許多優(yōu)勢(shì)：新型、高效率、周期短、選擇性提高、常溫、常壓。多數(shù)生物催化劑對(duì)人類和環(huán)境不構(gòu)成危害，通過避免使用高溫、高壓、避免金屬和有機(jī)溶劑的大量消耗，將大大降低單位產(chǎn)品的廢物產(chǎn)生量。

肌醇重要性已受到人們普遍關(guān)注，它的制取方法也日益成熟和多樣化。但目前肌醇傳統(tǒng)制取方法還存在有制約肌醇生產(chǎn)不利因素；生物工程技術(shù)生產(chǎn)肌醇也有待進(jìn)一步完善和成熟；肌醇在某些方面作用機(jī)理和應(yīng)用安全性還存在爭(zhēng)議，尚待進(jìn)一步研究。我國有豐富脫脂米糠、鼓皮等肌醇資源可供開發(fā)，且隨著研究不斷深入，人們對(duì)肌醇需求量將會(huì)越來越大，尤其是以肌醇為原料的保健食品、功能飲料和含有肌醇減壓降脂藥品，具有很大市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿6-10]。

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Process of Enzymatic Degradation of Phytic Acid in Rice Bran

HU Bin，CHAI Cheng，ZHAN Hu
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

2017-08-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.024

胡彬（1989—），男（漢），助理工程師，學(xué)士，研究方向：食品檢測(cè)與研發(fā)。