,,,,,,,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明 650201)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化云南武定雞胸肉酶解工藝

宋武剛1,2,王桂瑛1,2,程志斌2,谷大海1,2,徐志強1,2,朱仁俊1,*,廖國周1,2,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明650201)

武定雞,雞胸肉,水解度

Keywords:Wuding chicken;chicken breast;degree of hydrolysis

我國擁有極為豐富的地方優(yōu)質(zhì)肉雞品種資源,目前已經(jīng)成為第二大雞肉生產(chǎn)和消費國。肉雞在國內(nèi)市場上除整只活雞銷售外,主要是以各部位分割后制成熟食銷售,一些帶骨產(chǎn)品受到我國消費者的普遍歡迎,而具有高蛋白、低脂肪等特點的雞胸肉,因其口感不佳,市場開拓不夠廣,價格也偏低[1-3]。由于生產(chǎn)技術(shù)和加工設(shè)備的落后,我國肉雞的精深加工程度僅為5.8%,與世界的20%存在較大差距,而云南可能更低,而且受制于傳統(tǒng)消費觀念和飲食習(xí)慣及資金技術(shù)支持,云南地方優(yōu)質(zhì)肉雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢[4-6]。云南武定雞具有耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)細嫩鮮美的特點,為云南“六大名雞”之首,武定閹雞則是武定雞中的精品,被稱為“武定壯雞”,其肉質(zhì)更細嫩,氨基酸、必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸含量更高[7-9]。目前,武定雞的研究主要集中在營養(yǎng)成分測定及營養(yǎng)代謝相關(guān)基因的分析,對武定雞進行精深加工和產(chǎn)品開發(fā)鮮有報道[10-13]。

蛋白酶解技術(shù)在畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品的開發(fā)利用方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,通過蛋白酶水解蛋白質(zhì)可以提供高附加值產(chǎn)品,產(chǎn)品包括藥物、人類和動物營養(yǎng)品、化妝品、微生物氮源和天然抗氧化生物活性肽等,這些酶解產(chǎn)物經(jīng)過精深加工后,不僅具有優(yōu)于其他生物活性化合物的特點,而且能賦予產(chǎn)品營養(yǎng)與功能等性質(zhì)[14-17]。Schmidt[18]、白騰輝[19]、閆利萍[20]等人對雞胸肉酶解工藝條件進行了研究,孫楊贏[21]、唐道邦[22]等對雞胸肉酶解液的抗氧化活性做了研究,而利用這些酶解產(chǎn)物與氨基酸、還原糖和(或)香辛料發(fā)生美拉德反應(yīng)制備熱反應(yīng)香精和天然調(diào)味料的技術(shù)可以避免風(fēng)味的損失以及營養(yǎng)的流失,一直是研究的熱點[23]。因此,利用蛋白酶解技術(shù)可以對雞胸肉進行精深加工,不僅可以擴大雞胸肉產(chǎn)品的市場,還可以提高雞胸肉的附加值,創(chuàng)造更大的經(jīng)濟效益,具有廣泛的開發(fā)前景。本研究以150日齡武定閹母雞胸肉為原料,通過篩選高效的水解酶,研究了兩種酶復(fù)配的最佳酶解工藝條件,為后期開發(fā)特色風(fēng)味調(diào)味料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

150日齡武定閹母雞雞胸肉 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗種雞場;木瓜蛋白酶(80 U/g)、中性蛋白酶(10 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(10 U/g)、動物蛋白酶(15 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;甲醛和氫氧化鈉(分析純) 天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司;磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉(食品級) 連云港友進食品添加劑技術(shù)開發(fā)有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BCD-254冰箱 SIEMENS;101型干燥箱 北京中興;MJ-BL25c4攪拌機 廣東美的;JJ-1增力攪拌器 常州澳華;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特;DT5-2型低速臺式離心機 北京時代北利;KDN-04B半自動凱氏定氮儀 浙江托普。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分測定 采用GB/5009.3-2010中直接干燥法測定[24]。

1.2.2 總氮測定 參照GB/T 9695.11-2008測定[25]。

1.2.3 酶解工藝 雞胸肉→搗碎→一定pH緩沖液溶解→加酶→恒溫水解→滅酶(100 ℃,10 min)→離心(5000 r/min,10 min)→上清液為酶解產(chǎn)物。

1.2.4 單一酶篩選實驗 根據(jù)風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶性質(zhì)及預(yù)實驗結(jié)果確定酶解基本條件,以水解度為指標(biāo),考察不同酶的酶解效果。

1.2.4.1 酶添加量實驗 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間4 h,四種酶添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%(以雞胸肉干重計,下同),考察酶添加量對水解度的影響。

1.2.4.2 酶解時間實驗 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,四種酶添加量為0.25%,酶解時間分別為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h,考察反應(yīng)時間對水解度的影響。

1.2.4.3 酶解溫度實驗 固定四種酶添加量為0.25%,初始pH6.5,酶解時間4 h,酶解溫度分別為45、50、55、60 ℃,考察酶解溫度對水解的影響。

1.2.4.4 酶解pH實驗 固定四種酶添加量為0.25%,酶解溫度50 ℃,酶解時間4 h,酶解pH分別為5.5、6、6.5、7、7.5,考察酶解初始pH對水解度的影響。

1.2.5 復(fù)配酶單因素實驗 根據(jù)1.2.4所得到的實驗結(jié)果,以水解度為指標(biāo),研究酶復(fù)配比例、酶添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和pH對復(fù)配酶酶解效果的影響。

1.2.5.1 酶復(fù)配比例 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間5 h,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶總添加量為0.3%,研究兩種酶不同比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對酶解效果的影響。

1.2.5.2 復(fù)配酶添加量 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間5 h,木瓜蛋白酶與中性蛋白酶添加比例為2∶1,研究不同添加量(0.15%、0.225%、0.3%、0.375%、0.45%)對酶解效果的影響。

1.2.5.3 酶解時間 固定復(fù)配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),溫度50 ℃,初始pH6.5,研究不同酶解時間(3、3.4、4、4.5、5、5.5、6 h)對酶解效果的影響。

1.2.5.4 酶解溫度 固定復(fù)配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),時間5 h,初始pH6.5,研究不同酶解溫度(45、50、55、60 ℃)對酶解效果的影響。

1.2.5.5 酶解pH 固定復(fù)配酶添加量0.3%(木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=2∶1),時間5 h,溫度50 ℃,研究不同酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5)對酶解效果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗 根據(jù)1.2.5實驗結(jié)果,運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,以水解溫度(X1)、水解pH(X2)、酶添加量(X3)為變量,水解度為指標(biāo),實驗設(shè)計詳見表1及表3。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 1 Design of Box-Behnken response surface experiments

式中,V3-樣品體積,mL;c1-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,mol/L;0.014-1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當(dāng)于氮的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析與多重比較,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;響應(yīng)面實驗由Design-Expert 8.0.5b設(shè)計并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 武定雞胸肉基本成分分析

為計算蛋白酶的添加量(以雞胸肉的干重計)和水解度，故測定雞肉原料的水分含量和總氮含量，結(jié)果見表2。

表2 武定雞胸肉基本成分Table 2 The basic ingredients of chicken meat

2.2 單一酶對雞胸肉水解度的影響

2.2.1 單一酶添加量對雞胸肉水解度的影響 由圖1知,隨著酶添加量增加,水解度增大,達到一定量后變化趨于平穩(wěn)。其中,木瓜蛋白酶是水解度最大酶,在0.25%時,水解度最大,為26.49%,且與0.3%、0.35%添加量的水解度差異不明顯(p>0.05);風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白酶和中性蛋白酶在添加量為0.3%時水解度達到最大,分別為8.65%、17.50%和22.37%,且與其他添加量的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),當(dāng)添加量為0.35%時,水解度卻有所下降。

圖1 單一酶添加量對水解度的影響Fig.1 Effect of addition of single enzyme on DH

2.2.2 單一酶酶解時間對雞胸肉水解度的影響 由圖2可知,隨著反應(yīng)的進行,水解度逐漸增大,在反應(yīng)5 h后趨于平緩,說明反應(yīng)接近完成,反應(yīng)5 h時,風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度分別為10.16%、18.53%、25.74%、18.94%。從實驗結(jié)果分析可知,四種酶5 h水解度與3、3.5、4、4.5 h的水解度差異極顯著(p<0.01),且與6 h的水解度差異不顯著(p>0.05),說明底物在5 h內(nèi)基本被酶解完全,而且酶解時間過長,會提高生產(chǎn)成本,因此適宜酶解時間為5 h。

圖2 單一酶酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic time of single enzyme on DH

2.2.3 單一酶酶解溫度對雞胸肉水解度的影響 由圖3可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,水解度先上升后下降。風(fēng)味蛋白酶在50 ℃時水解度達到最大,水解度為10.43%,相比其他反應(yīng)溫度的水解度,差異極顯著(p<0.01),而動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在55 ℃時,水解度達到最大,分別為17.09%、26.49%、21.34%。其中,木瓜蛋白酶在55 ℃的水解度相比其他溫度的水解度,差異極顯著(p<0.01),中性蛋白酶在45～55 ℃之間,水解度差異不明顯,但與60 ℃相比,差異極顯著(p<0.01)。

圖3 單一酶酶解溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperature of single enzyme on DH

2.2.4 單一酶酶解pH對雞胸肉水解度的影響 由圖4可知,風(fēng)味蛋白酶在pH為6.5時,水解度最大,為11.94%,而動物蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度在pH為7.0時,達到最大,分別為20.52%、28.82%、24.84%。通過對實驗數(shù)據(jù)進行分析可知,風(fēng)味蛋白酶在pH為6.5時的水解度與pH為5.5、6.0、7.5時的水解度差異極顯著(p<0.01),而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在pH為7.0時的水解度與pH為5.5、6.0、6.5、7.5時的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),動物蛋白酶在pH為7.0時的水解度與pH為5.5、6.0和6.5時的水解度相比,差異也極顯著(p<0.01)。

圖4 單一酶酶解pH對水解度的影響Fig.4 Effect of reaction pH of single enzyme on DH

通過以上實驗,考察了酶添加量，酶解時間、溫度和pH四個因素對水解度的影響,發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶在四個因素實驗中,水解度都是最高的,而中性蛋白酶次之,且與木瓜蛋白酶反應(yīng)條件相似,在各個單因素實驗中,最高的木瓜蛋白酶水解度大概是水解度最低的風(fēng)味蛋白酶的3倍。木瓜蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶類,能水解甘氨酸、賴氨酸和精氨酸等的蛋白底物,中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶類,能水解苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等的底物,兩種酶復(fù)配,極大的增大了可水解的底物范圍,且本研究以水解度為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解雞胸蛋白的水解度明顯高于其余兩種蛋白酶,兩種蛋白酶復(fù)配水解雞胸肉蛋白的水解度明顯高于單一酶水解,故選出木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進行復(fù)配。

2.3 復(fù)配酶對雞胸肉水解度的影響

2.3.1 復(fù)配酶復(fù)配比例對雞胸肉水解度的影響 雞胸肉蛋白質(zhì)中的各種氨基酸含量是不同的,而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶所作用的氨基酸殘基是不同的,因此,不同比例酶組合,水解度不同。由圖5可知,酶復(fù)配比例在木瓜蛋白酶與中性蛋白酶比為2∶1時,水解度最大,為32.87%,通過實驗數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶比中性蛋白酶為2∶1時的水解度與其余復(fù)配比例相比,差異極顯著(p<0.01),因此,實驗選擇木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)配比例為2∶1。

圖5 酶復(fù)配比例對水解度的影響Fig.5 Effect of the ratio of two enzymes on DH

2.3.2 復(fù)配酶添加量對雞胸肉水解度的影響 由圖6可知,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶添加量0.15%～0.375%時,水解度不斷增大,且差異極顯著(p<0.01),在0.375%時水解度最大,為36.92%。當(dāng)酶添加量從0.375%增加到0.45%,水解度不再增加反而出現(xiàn)下降,且兩者水解度差異極顯著(p<0.01),當(dāng)酶濃度過高時,可能還會不利于反應(yīng)的進行,這可能是由酶的性質(zhì)決定的,酶既能促進正反應(yīng),也能促進逆反應(yīng)的進行,因此,酶的添加量要適可而止。

圖6 復(fù)配酶添加量對水解度的影響Fig.6 Effect of addition of two enzymes on DH

2.3.3 復(fù)配酶酶解時間對雞胸肉水解度的影響 由圖7可知,當(dāng)酶解時間由3 h增至5 h時,水解度明顯增大,差異極顯著(p<0.01),在5 h時,水解度達到了34.25%,當(dāng)酶解時間由5 h增加到6 h時,水解度趨于平緩,差異也不顯著(p>0.05),從實際成本及其他因素考慮,選擇反應(yīng)時間為5 h。

圖7 復(fù)配酶酶解時間對水解度的影響Fig.7 Effect of enzymatic time of two enzymes on DH

2.3.4 復(fù)配酶酶解溫度對雞胸肉水解度的影響 由圖8可知,當(dāng)溫度從45 ℃上升到55 ℃時,水解度逐漸增大,在55 ℃時水解度達到最大值,為34.38%,與45和50 ℃的水解度相比,差異極顯著(p<0.01),溫度繼續(xù)升高,可能部分酶失去了活性,水解度降低,實驗數(shù)據(jù)分析顯示與溫度為55 ℃時水解度相比,差異也是極顯著的(p<0.01)。

圖8 復(fù)配酶酶解溫度對水解度的影響Fig.8 Effect of enzymatic temperature of two enzymes on DH

2.3.5 酶解pH對雞胸肉水解度的影響 由圖9可知,當(dāng)pH由6.0上升到7.0時,水解度呈上升趨勢,在pH為7.0時,達到最大值為31.77%,當(dāng)pH超過7.0后,水解度又下降,結(jié)果顯示pH7.0時的水解度與pH6.0、7.5時的水解度差異極顯著(p<0.01),這結(jié)果是完全符合酶的特性,因為酶都具有一定適宜的反應(yīng)pH,不適宜的條件都會影響酶的活性。

圖9 復(fù)配酶酶解pH對水解度的影響Fig.9 Effect of reaction pH of two enzymes on DH

通過單一酶的單因素和復(fù)配酶的實驗結(jié)果可知,復(fù)配酶解的效果要優(yōu)于單一酶酶解,水解度隨反應(yīng)時間延長呈現(xiàn)先上升后平緩,且考慮到經(jīng)濟成本等原因,選擇5 h,該因素不參與后續(xù)的響應(yīng)面實驗的優(yōu)化,所以選擇了溫度、pH、酶添加量等三個因素進行優(yōu)化實驗。

2.4 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

注:“**”表示差異極顯著，p<0.01。

表3 Box-Behnken實驗方案及結(jié)果Table 3 Design and results of the response surface experiments

圖10 溫度與pH(A)、溫度與酶添加量(B)和pH與酶添加量(C)交互影響雞胸肉水解度曲面圖Fig.10 Graph on interaction effect of reaction temperature and pH(A),reaction temperature and enzyme addition(B),pH and enzyme addition(C) on the degree of chicken breast hydrolysis

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken實驗設(shè)計并通過響應(yīng)面法優(yōu)化修正后得到雞胸肉最佳的酶解工藝條件為木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加量分別為0.27%和0.13%,反應(yīng)溫度54.3 ℃,pH為6.8,在此條件下,反應(yīng)時間5 h后,雞胸肉酶解液的水解度達到了36.03%±0.31%,與預(yù)測值36.26%基本吻合,說明此方程與實際擬合較好,驗證了此模型的合理性。

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OptimizationofenzymatichydrolysisprocessofYunnanWudingchickenbreastmeatbyresponsesurfacemethodology

SONGWu-gang1,2,WANGGui-ying1,2,CHENGZhi-bin2,GUDa-hai1,2,XUZhi-qiang1,2,ZHURen-jun1,*,LIAOGuo-zhou1,2,*

(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Provine,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

TS251.5+5

A

1002-0306(2017)18-0099-06

2017-02-07

宋武剛(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：肉品加工與質(zhì)量控制，E-mail:allens1987@126.com。

*通訊作者:朱仁俊(1968-)，男，碩士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail:2421125021@qq.com。 廖國周(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制，E-mail:liaoguozhou@ynau.edu.cn。

云南特色資源風(fēng)味調(diào)料產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化(2013IB010)；云南省科技計劃項目重大科技專項(2016ZA008)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.020