, ,, ,

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

酪蛋白胃腸模擬水解液活性檢測及細(xì)胞吸收機(jī)制初步研究

薛海燕,李珊,杜枘宣,韓波,張穎

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安710021)

目的:研究牛乳酪蛋白在胃腸模擬水解條件下水解物的生物活性,以及這些肽類在細(xì)胞水平的吸收機(jī)制,為蛋白質(zhì)生理作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法:以牛乳酪蛋白為原料,對其進(jìn)行體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn),通過檢測消化液的DPPH自由基清除率和抑菌圈大小,分析其抗氧化和抗菌活性;建立Caco-2單層細(xì)胞模型對水解液進(jìn)行過膜吸收,RP-HPLC分析過膜前后消化液組成,研究吸收情況。結(jié)果:模擬胃和腸消化時(shí)間均在2 h時(shí),牛乳酪蛋白消化液的DPPH自由基清除率達(dá)到最大,分別為46.40%和56.7%,并且此時(shí)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性能最強(qiáng);細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)表明2 h胃模擬水解液肽氮生物利用度達(dá)到7.79%,2 h腸模擬水解液達(dá)到15.11%,之后基本持平;親水性的多肽能被成功吸收進(jìn)入單細(xì)胞層下側(cè),但疏水性多肽大部分不易通過,易被降解或阻止。結(jié)論:牛乳酪蛋白在模擬消化條件下能產(chǎn)生生物活性肽類,并能被腸細(xì)胞吸收。

酪蛋白,胃腸模擬消化,抗氧化活性,Caco-2細(xì)胞

Abstract:Objective:To study on bioative detetion and cell-based absorption mechanisms of gastrointestinal hydrolysis derived from bovine casein. It can further elucidate physiological mechanisms of food protein to humanbeing.Methods:Bovine milk casein was hydrolyzedinvitrosimulating gastrointestinal digestion. The hydrolysate’s antioxidant and antimicrobial activity were detected through the DPPH free radical clearance rate analysis and the bacteriostatic ring size determination. In addation,Caco-2 monolayer cell model was optimizated and established to simulate the membrane absorption of hydrolysate. RP-HPLC was used to analyze the digestive juices before and after across the membrane.Results:It showed the DPPH free radical clearance rates reached maximum,46.40% of 2 h-Gastricand 56.7% of 2h-Gastroin-testinal digestions from bovine casein. At the same time,the inhibition activity onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusalso achieve maximum. Experiment results showed that hydrolyzed 2 h stomach simulation peptide absorption nitrogen bioavailability of 7.79%,2 h hydrolyzed imtestines simulation of 15.11%,after the flat.The peptide can be successfully absorb water into single cell layer under the side,but most hydrophobic peptide by not easily,easy degradation or stop.Conclusion:The gastrointestinal hydrolysate of casein can produce bioactive peptides as well as absorb by intestinal cell monolayer.

Keywords:casein;gastrointestinal digestion;antioxidant activity;Caco-2 cells

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)成分之一。近幾年,蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生的活性多肽成為研究熱點(diǎn)[1]。來源于食品的生物活性肽在動(dòng)物進(jìn)食消化后,不只為機(jī)體提供基本營養(yǎng)成分,還可能發(fā)揮一定的生理功能[2]。這些發(fā)現(xiàn)使得營養(yǎng)學(xué)家在評定蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值時(shí),不僅要考慮蛋白質(zhì)中的必需氨基酸含量,還應(yīng)考慮在消化過程中是否會(huì)產(chǎn)生一些具有潛在生理功能的活性肽[3]。而牛乳酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸[4],經(jīng)體外酶可控水解后可以產(chǎn)生多種生理活性肽,如免疫活性肽、腎素肽、抗氧化肽、酪蛋白磷酸肽(CPP)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE抑制肽)等[5]。目前研究大多集中于體外酶解蛋白制備乳源生物活性肽方面[6]。如Maruyama等人使用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白,在水解液中得到三種降血壓的二肽其肽段分別為:PP、RP及AH[7];徐鑫等人用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白,測定水解物對小鼠脾細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用達(dá)到0.184[8]。但關(guān)于蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸水解后是否會(huì)產(chǎn)生理活性肽,具有生理活性的多肽進(jìn)入胃腸道后能否被吸收,生理活性肽是否能完整通過小腸上皮細(xì)胞及通過的機(jī)制研究報(bào)道較少[9]。

利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以很好地進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的吸收評價(jià),但結(jié)構(gòu)完整性的維持是生理活性肽功能發(fā)揮的前提,動(dòng)物機(jī)體復(fù)雜,體內(nèi)多肽追蹤困難[10]。而Caco-2細(xì)胞單層膜具有與腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和緊密連接,并且表達(dá)出與腸上皮細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相同的轉(zhuǎn)運(yùn)載體;在細(xì)胞培養(yǎng)的AP側(cè)生長出的刷狀緣微絨毛也同樣表達(dá)氨肽酶、堿性磷酸酶和磺基轉(zhuǎn)移酶等,這些酶在小腸刷狀緣也都存在[11]。Caco-2腸道單層細(xì)胞模型由于其重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于藥物或食物營養(yǎng)素在腸道中的吸收評價(jià)中[12]。

因此,本研究通過模擬胃腸水解牛乳酪蛋白得到多肽水解液,檢測水解液中多肽的抗氧化活性和抑菌活性,以Caco-2單層細(xì)胞膜為模型,模擬體內(nèi)腸道吸收、轉(zhuǎn)運(yùn),使水解多肽通過單層細(xì)胞,采用RP-HPLC對AP側(cè)和BL側(cè)的樣品進(jìn)行檢測,對多肽的吸收進(jìn)行初步研究,從而為蛋白質(zhì)營養(yǎng)生理作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

酪蛋白、胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(3000 U/mg)、DPPH(分析純) 美國Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、Caco-2細(xì)胞、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 南京凱基生物發(fā)展有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液 美國Hyclone公司;Hank’s平衡鹽溶液(HBSS) 美國Sigma公司;25 cm2培養(yǎng)瓶、12孔透明Transwell板(膜面積0.33 cm2) 美國康寧公司。

1200LC型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司;752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;HF90 CO2培養(yǎng)箱 上海力申儀器有限公司;Ti-U型倒置相差顯微鏡 大恒圖像有限公司;細(xì)胞電阻儀 美國MILLIPORE MILLICELL-ER;MULTISKAN mk3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾上海儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白水解物的制備

1.2.1.1 人工胃液和人工腸液的制備 參照文獻(xiàn)[13]中的方法。人工胃液:1 g胃蛋白酶溶解于50 mg超純水中,加入1.64 mL 10% HCl溶液,定容至100 mL,備用。

人工腸液:稱取0.68 g磷酸二氫鉀加到50 mL超純水中,用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8,加入1 g胰蛋白酶,定容至100 mL,備用。

1.2.1.2 體外模擬胃消化 稱取12 g酪蛋白溶于500 mL pH為8的PBS中,振蕩使其充分溶解后,用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至2.0。將20 mL人工胃液加入酪蛋白溶液中,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中模擬消化,在0、1、2、3、4、5 h分別取樣50 mL,然后將所得樣品在沸水中滅酶10 min,調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)4.6以沉淀未消化的酪蛋白,10000 r/min離心30 min,分離獲得上清,NaOH調(diào)節(jié)上清溶液pH至8.0,將所得樣品凍干儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用,其中0 h為對照。

1.2.1.3 體外模擬腸消化 按照1.2.1.2方法制備2 h酪蛋白胃消化液500 mL,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0,加20 mL的人工腸液,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中繼續(xù)模擬消化,取樣時(shí)間、取樣量及保存方式同1.2.1.2。

1.2.2 酪蛋白水解液抗氧化及抗菌活性檢測

1.2.2.1 酪蛋白水解液抗氧化檢測 采用DPPH法[14]對水解液的DPPH自由基清除率進(jìn)行測定。

將所有比色管均置于25 ℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)30 min后于λ=517 nm處測定其吸光度,每個(gè)濃度測定3次,取平均值,測定結(jié)果以清除率(SR)表示。用等體積無水乙醇作為空白調(diào)零。計(jì)算公式為:

式中:A0:DPPH(1×10-4mol/L)的吸光度;Ai:DPPH與水解液混合液的吸光度;Aj:水解液的吸光度。

1.2.2.2 酪蛋白水解液的抑菌活性檢測 參照文獻(xiàn)[15]中的方法,選擇不同類型微生物的典型代表進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn),大腸桿菌作為革蘭氏陰性(G-)菌的典型代表進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。將1×108CFU/mL的菌液均勻涂布接種在瓊脂平面上,孔內(nèi)加入不同水解時(shí)間的多肽液樣品,37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[16]中的方法,Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液為加入10%胎牛血清和2%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,將1×104CFU/mL的第7代Caco-2細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,在37 ℃,5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待其生長至80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液進(jìn)行消化并傳代。選取其中兩株,濃度調(diào)整至2×105CFU/mL,將其接種于Transwell板上,在37 ℃,5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),開始培養(yǎng)的一周內(nèi)隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液,一周后每天更換培養(yǎng)液,直至成膜,檢測單層膜模型的建立。所用單層膜細(xì)胞傳代均在20代以內(nèi)。

1.2.3.2 成膜完整性檢測 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn):培養(yǎng)至21 d時(shí),將細(xì)胞用HBSS緩沖溶液沖洗3次,在電子顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征?？缒る娮鑄EER值測定[17]:用細(xì)胞電阻儀測定跨膜電阻(在700～1500 Ω·cm2之間符合要求),Caco-2細(xì)胞膜細(xì)胞電阻值(Ω·cm2)=(Caco-2細(xì)胞膜電阻值-空白膜電阻值)×膜面積。

熒光黃檢漏實(shí)驗(yàn)[18]:熒光黃標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:用HBSS配制10 mg/mL的熒光黃溶液,然后稀釋至1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01 mg/mL,用酶標(biāo)儀在495 nm處檢測其吸光度,以濃度為橫坐標(biāo)X,吸光度為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=124.79X+0.12796,R2=0.997。

Caco-2單層細(xì)胞膜的滲透率和表觀滲透系數(shù)(Papp):將0.5 mL 0.4 mg/mL的熒光黃溶液加入Transwell的AP側(cè),然后向BL側(cè)加入1.5 mL的HBSS緩沖溶液,分別在0、30、60、90、120、150 min在BL取樣200 μL,然后添加同體積的HBSS緩沖溶液,在495 nm處檢測其吸光度,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒光黃的濃度。以未接種細(xì)胞的Transwell板做為空白組。熒光黃的滲透率公式及表觀滲透系數(shù)計(jì)算公式如下:

式中:Papp:表觀滲透系數(shù),cm/s;dQ/dt:單位時(shí)間內(nèi)熒光黃的轉(zhuǎn)運(yùn)量;A:膜的表面積,cm2;C0:AP側(cè)中熒光黃的初始濃度,mg/mL。

1.2.3.3 多肽水解液的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[19]中的方法,Caco-2細(xì)胞在Transwell板上形成緊密完整的單細(xì)胞層后,用HBBS沖洗板中各孔室的細(xì)胞3次,然后在每個(gè)孔室中都加入1 mL的HBBS,并放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min,除去細(xì)胞膜表面的附著物、培養(yǎng)基質(zhì)和HBBS緩沖液。牛乳酪蛋白多肽水解液用HBSS稀釋至5 mmol/L。多肽水解液從A池至B池的過膜實(shí)驗(yàn)操作:在A池加入0.5 mL水解液,B池加0.5 mL的HBSS,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后,分別在B池中收集過膜液0.5 mL,平行3個(gè)孔。檢測AP及BL多肽氮含量,HPLC檢測2 h水解液組成。

1.2.4 測定水解液中肽氮含量和生物利用度 用凱氏定氮法測定消化液中總氮含量[20]。TNBS法測定消化液中游離氨基酸氮含量[21]。

肽氮含量(g)=總氮含量-游離氨基氮含量

1.2.5 水解液RP-HPLC檢測 將各酪蛋白水解液樣品用0.45 μm的濾膜微濾上樣。色譜條件:色譜柱:Diamonsil TMC18(Φ4.6 mm×250 mm,5 μm);進(jìn)樣量:20 μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長:220 nm;柱溫:30 ℃;流動(dòng)相A:含0.1% TFA乙腈,流動(dòng)相B:含0.1% TFA超純水;0～30 min,10%～35%流動(dòng)相A;30～40 min,35%～10%流動(dòng)相A;40～50 min,10%流動(dòng)相A[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Origin軟件作圖并用SPSS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白胃腸水解液抗氧化性分析

由圖1可知,酪蛋白胃水解液的DPPH·自由基清除率先增大后減小。在水解2 h前抗氧化活性逐漸增強(qiáng),到2 h時(shí)DPPH·自由基清除率達(dá)到最大值46.40%;隨著反應(yīng)的進(jìn)行,DPPH·自由基清除率有所下降,最后趨于平緩,維持在34.51%左右,2 h后分子變小,抗氧化活性反而降低。食物蛋白質(zhì)在胃內(nèi)的停留時(shí)間為4～5 h,因此酪蛋白的模擬胃水解多肽在胃內(nèi)具有抗氧化活性。酪蛋白腸水解液的DPPH·自由基清除率先增大后減小,2 h DPPH自由基清除率達(dá)到最大56.7%;2 h以后繼續(xù)消化,肽段被水解為更小分子的肽段或者氨基酸,使部分肽段的抗氧化活性降低,DPPH自由基清除率在3、4、5 h分別降至53.50%、51.80%、50.68%,但仍保持一定活性,這是由于某些氨基酸的特殊結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化活性,如組氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸等[23],所以水解時(shí)間內(nèi)的DPPH自由基清除率與0 h相比均升高。并且人工腸液的消化物的DPPH自由基清除率明顯高于人工胃液消化物(p<0.05),這可能是由于人工腸液消化的水解度較大,生成了較多具有抗氧化活性的多肽。

圖1 不同時(shí)間胃腸水解液對自由基清除率的影響Fig.1 The influence of gastric and intestinal intestinal juice hydrolysis time on free radical clearance

2.2 酪蛋白水解液抗菌活性檢測

由表1可知,酪蛋白并沒有顯著抑菌作用。兩種受試菌中均表現(xiàn)為抑菌圈直徑大小隨時(shí)間的延長先增大后減小,直到最后不產(chǎn)生抑菌圈。其中水解2 h的多肽液抑菌圈直徑最大,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有最強(qiáng)的抑菌效果,即對革蘭氏陰性菌與陽性菌均能產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)水解時(shí)間在2～5 h范圍時(shí),具有抑菌活性的多肽進(jìn)一步被水解成沒有抗菌活性的小肽片斷,因此多肽液的抑菌圈直徑隨水解時(shí)間延長而逐漸減小,當(dāng)抗菌活性肽濃度低于最小抑菌濃度時(shí)就不再有抑菌圈出現(xiàn)。

由表2可知,腸消化物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性在2 h時(shí)顯著升高(p<0.05),對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均達(dá)到較高值,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,抑菌活性又明顯降低。出現(xiàn)這種趨勢是由于人工胃液消化產(chǎn)生的具有抑菌活性的肽段,經(jīng)過人工腸液再消化將進(jìn)一步消化,從而使其降解為活性較低的肽段,但隨著消化時(shí)間的延長,又形成了一些新的小分子活性肽段,從而使抑菌能力有所提高,之后這些小分子的活性肽段又被進(jìn)一步分解[6]。

表1 不同時(shí)間胃水解液對兩種菌的抑菌圈直徑Table 1 Different time stomach hydrolysate on bacteriostatic circle diameter of two kinds of bacteria

注:a表示與0 h相比差異顯著(p<0.05);表2同。

表2 不同時(shí)間腸水解液對兩種菌的抑菌圈直徑Table 2 Different time of intestine hydrolysate on bacteriostatic circle diameter of two kinds of bacteria

2.3 Caco-2單層細(xì)胞膜模型的建立

2.3.1 Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果分析 細(xì)胞顯微鏡觀察顯示,在經(jīng)過1 d培養(yǎng)后,細(xì)胞為不規(guī)側(cè)的扁狀,培養(yǎng)21 d時(shí),細(xì)胞生長均勻,無白泡,可清楚看見Caco-2細(xì)胞形狀為不規(guī)則的扁狀,細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞之間緊密連接。但是無法證明單層膜的致密程度,其致密度還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 Caco-2細(xì)胞在Transwell板上培養(yǎng)單層膜形態(tài)圖(10×)Fig.2 Caco-2 cells are grown on the Transwell board form figuremonolayer film(10×) 注:左圖為培養(yǎng)1 d,右圖為培養(yǎng)21 d的細(xì)胞單層膜。

2.3.2 細(xì)胞TEER結(jié)果分析 12孔Transwell板上測得的TEER值如圖3所示。Caco-2細(xì)胞單層膜的致密性隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而呈遞增趨勢。前8 d細(xì)胞的跨膜電阻增長較慢,到第8 d電阻達(dá)到(321±25) Ω·cm2,之后快速增大,第21 d時(shí)達(dá)到(1086±50) Ω·cm2,最后3 d增長趨于平緩,穩(wěn)定在1100 Ω·cm2左右,與其它組的電阻率存在顯著性差異(p<0.05),說明Caco-2細(xì)胞形成了致密完整的單層膜,可以進(jìn)行過膜實(shí)驗(yàn)。

圖3 Caco-2細(xì)胞單層膜TEER值隨時(shí)間變化圖Fig.3 Caco-2 cell monolayer TEER value variation over time

2.3.3 熒光黃通透性的結(jié)果分析 利用熒光黃來檢測Caco-2單層膜表觀通透性(Papp),由于離子經(jīng)過細(xì)胞旁間隙透過的量恒定,故用標(biāo)記物熒光黃進(jìn)行細(xì)胞間隙和致密度檢測。細(xì)胞緊密完整,則Papp值要小于0.5×10-6cm/s值,且Papp值還要處于10-6cm/s數(shù)量級(jí)上[24]。熒光黃濃度檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=124.79X+0.12796,R2=0.997;熒光黃的Papp值為0.37×10-6cm/s,小于0.5×10-6cm/s,達(dá)到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中的范圍[18],且平均透過率為0.37%,而空白對照組Papp值為5.9×10-5cm/s,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.5×10-6cm/s,且平均透過率為95%。結(jié)果表明:Caco-2細(xì)胞在Transwell板中連續(xù)培養(yǎng)21 d,所建立的Caco-2單層膜致密、完整,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,可以用于過膜實(shí)驗(yàn)。

2.4 水解液中肽氮含量和生物利用度

收集不同時(shí)間水解液分別過單層Caco-2細(xì)胞膜后,檢測此時(shí)的肽氮生物利用率,如圖4所示,消化2 h的胃液生物消化率達(dá)到7.79%,消化2 h的胃腸水解液達(dá)到15.11%,之后基本持平,說明2 h后隨著酶切位點(diǎn)減少,蛋白酶的活性達(dá)到飽和,生物利用度增加緩慢,直到5 h才分別增加了1.08%和1.77%。從圖4中還可以看出，胰蛋白酶的水解度顯著高于胃蛋白酶的水解度(p<0.05),說明胰蛋白酶更易水解酪蛋白。

圖4 不同消化時(shí)間胃腸液過膜前后生物利用度Fig.4 Bioavailability of AP and BL of casein hydrolysate at the different digestion time

2.5 酪蛋白在腸Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收

對Transwell的A、B池多肽水解液通過RP-HPLC檢測進(jìn)行對比分析,RP-HPLC檢測結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 胃水解多肽液過膜前后HPLC分析圖Fig.5 Stomach hydrolytic polypeptide liquid membrane before and after RP-HPLC analysis diagram注:A為體外胃水解2 h多肽液;B為A側(cè)剩余多肽液;C為過膜后B側(cè)多肽液;上方箭頭表示為通過部分;下方箭頭為消失部分;下方粗箭頭為未通過部分,圖6同。

圖6 腸水解多肽液過膜前后HPLC分析圖Fig.6 Pancreatic enzyme hydrolysis polypeptide liquid membrane before and after RP-HPLC analysis diagram注:A為體外腸水解2h多肽液;B為A側(cè)剩余多肽液;C為過膜后B側(cè)多肽液。

從圖5可知,經(jīng)Caco-2單層細(xì)胞吸收后,在保留時(shí)間為18.10、22.20、25.50、27.21、33.24 min等的峰可以通過Caco-2單細(xì)胞層,還有26.04、31.00 min等的峰未在B、C上出現(xiàn)。從圖6可知,經(jīng)Caco-2單層細(xì)胞吸收后,在保留時(shí)間為18.11、19.00、22.03、24.11、25.50、27.13、33.20 min等的峰可以通過Caco-2單細(xì)胞層,28.00、33.01 min的峰未能通過單層細(xì)胞膜,23.40、23.70、29.20、34.00 min時(shí)的峰未在B、C上出現(xiàn)。推測多肽可能被膜上相關(guān)代謝酶水解。

據(jù)報(bào)道,當(dāng)用RP-HPLC C18柱檢測多肽液時(shí),保留時(shí)間為12～23 min和23～30 min的峰分別為親水性多肽和疏水性多肽,不能被單層膜吸收的多肽既有親水性也有疏水性,親水性多肽更易于通過,疏水性多肽不易通過,易被降解或阻止[25],被膜上相關(guān)代謝酶水解的多肽同樣為疏水性多肽,同時(shí)疏水性多肽未通過的時(shí)間段明顯高于親水性。如圖5中26.04、31.00 min的峰,圖6中23.40、29.20 min的峰。由于細(xì)胞有3種不同的運(yùn)輸路線,包括載體運(yùn)輸、細(xì)胞間連接的運(yùn)輸和胞吞胞吐,這三種方式選擇性的參與到親疏水多肽的運(yùn)輸中。每個(gè)多肽的結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同,可能存在多種運(yùn)輸路線,而且在腸吸收時(shí)疏水性的多肽還有一定的過膜量,所以親水性多肽大部分、疏水性小部分可以被成功吸收進(jìn)入單細(xì)胞層下側(cè)。

3 結(jié)論

酪蛋白的水解產(chǎn)物隨著水解時(shí)間延長,使水解物中肽段進(jìn)一步分解,導(dǎo)致其抗氧化活性在水解2 h后呈現(xiàn)降低趨勢。胃腸水解液中的抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用,對革蘭氏陰性菌與陽性菌均能產(chǎn)生抑制作用,具有較廣的抗菌譜。這與水解液中的多肽組成有關(guān)系,亟待進(jìn)一步的研究。RP-HPLC結(jié)果顯示,親疏水性的多肽能被成功吸收進(jìn)入單細(xì)胞層下側(cè),但疏水性多肽大部分不易通過,易被降解或阻止,也證明多肽兩極的肽段能被腸液優(yōu)先消化水解,并且可以產(chǎn)生許多親水性的多肽,而親水性的多肽能夠保持更多肽鏈不受腸消化的破壞,所以水解作用引起總的疏水性減少,一些肽鍵被分解為兩個(gè)高親水性的化學(xué)基團(tuán)。

[1]Hogan S,Lei Z,Li J,et al. Development of antioxidant rich peptides from milk protein by microbial proteases and analysis of their effects on lipid peroxidation in cooked beef[J]. Food Chemistry,2009,117(3):438-443.

[2]Meisel H.Bioactive peptides from milk protein:a perspective for consumers and producers[J].Austr J Dairy Technol,2001(56):83-91.

[3]宮霞,凌慶芝. 乳酪蛋白源抗高血壓活性肽的制備及其生理活性[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào),2009,27(1):53-56.

[4]Plank J,Andres P,Krause I,et al. Gram scale separation of casein proteins from whole casein on a Source 30Q anion-exchange resin column utilizing fast protein liquid chromatography(FPLC)[J]. Protein Expression & Purification,2008,60(2):176-181.

[5]Silva S V,Malcata F X.Caseins as source of bioactive peptides[J].International Dairy Journal,2005,15(1):1-15.

[6]龐廣昌,陳慶森,胡志和,等. 蛋白質(zhì)的消化吸收及其功能評述[J]. 食品科學(xué),2013,34(9):375-391.

[7]Maruyama S,Mitachi H,Tanaka H,et al. Studies on the active site and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitors derived from casein[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1987,51(6):1581-1586.

[8]徐鑫,何佳易,劉國艷,等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化胰蛋白酶酶解條件制備乳源免疫活性肽[J]. 食品科學(xué),2011,32(19):174-179.

[9]劉珊珊,敖靜,謝寧寧,等. 酪蛋白抗氧化肽的胃腸消化穩(wěn)定性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2014,14(2):47-53.

[10]吳軍,翁春梅,劉曉東,等.外翻腸囊法研究靈仙新苷腸吸收動(dòng)力學(xué)[J].中國新藥雜志,2014,23(5):601-605.

[11]關(guān)溯,陳孝,黃民.Caco-2細(xì)胞模型-藥物吸收研究的有效“工具”[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2004,20(6):609-614.

[12]丁龍. 蛋清源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)與完整吸收關(guān)系研究[D]. 長春:吉林大學(xué),2015.

[13]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].第二版.北京,中國醫(yī)藥科技出版社,2005:158.

[14]Guo H,Kouzuma Y,Yonekura M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein.[J]. Food Chemistry,2009,113(1):238-245.

[15]謝強(qiáng),林玉桓,苗淑萍,等. 香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(23):54-58.

[16]Gianluca Picariello,Giuseppe Iacomino,Gianfranco Mamone,et al. Transport across Caco-2 monolayers of peptides arising frominvitrodigestion of bovine milk proteins[J]. Food Chemistry,2013(139):203-212.

[17]Hosoya K-I,Kim K-J,Lee V H. Age-dependent expression of P-glycoprotein gp17O in Caco-2 cell monolayers[J]. Pharmaceutical Research,1996,13(6):885-890.

[18]尤青,馬增春,譚洪玲,等.人參水提物在Caco-2模型的吸收特征[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013,29(12):1711-1716.

[19]Ranaldi G,Conaalvo R,Sambuy Y,et al.Permeability characterististics of parental and clonal human intestinal Caco-2 cell lines differentiated in serum supplemented and serum-free media[J].Toxicol InVitro,2003,17(5-6):76-767.

[20]魯健章,孫麗華,周彥鋼. 凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)含量的干擾因素分析[J]. 食品科學(xué),2010,31(19):453-456.

[21]Samaranayaka A G,Kitts D D,Li-Chan E C. Antioxidative and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory potential of a Pacific Hake(Merlucciusproductus)fish protein hydrolysate subjected to simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell permeation[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2010,58(3):1535-1542.

[22]Ningning Xie,BoWang,Liangping Jiang,et al. Hydrophobicity exerts different effects on bioavailability and stability of antioxidant peptide fractions from casein during simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell absorption[J].Food Research International,2015(76):518-526.

[23]李東平. 酶解水牛乳蛋白制備降血壓肽的研究[D]. 南寧:廣西大學(xué),2012.

[24]莫李立,王素軍,楊本坤.阿魏酸在Caco-2細(xì)胞模型的通透性及其在大鼠體內(nèi)吸收特性研究[J].中草藥,2012,43(5):947-951.

[25]Parrot S,Degraeve P,Curia C,et al.Invitrostudy on digestion of peptides in Emmental cheese:analytical evaluation and influence on angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides[J]. Die Nahrung,2003,47(2):87.

Thebioacitvedetectionandmechanismofcell-basedabsorptiononsimulatinggastrointestinalhydrolysisofcasein

XUEHai-yan,LIShan,DURui-xuan,HANBo,ZHANGYing

(Institute of Food Biotechnology,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0014-06

2017-02-28

薛海燕(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品免疫檢測技術(shù)，E-mail：xuehaiyan@sust.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301405)；陜西省科技統(tǒng)籌計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTZB02-02-05(2))；陜西省教育廳專項(xiàng)項(xiàng)目(16JK1101)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.003