李 建 肖修玲 李 彥 鄒曉平 鄧 超#

重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院消化科1(405400) 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

低濃度葫蘆素-I誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究

李 建1*肖修玲1李 彥1鄒曉平2鄧 超1#

重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院消化科1(405400)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2

背景：葫蘆素-I通過抑制STAT3信號通路在多種惡性腫瘤中發(fā)揮強(qiáng)大的抗癌作用，但其在胃癌中是否同樣具有抗癌作用及其作用機(jī)制，目前仍不清楚。目的：通過體外實(shí)驗(yàn)評估低濃度葫蘆素-I對人胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響并初步探討其可能作用機(jī)制。方法：以低濃度葫蘆素-I處理人胃腺癌細(xì)胞株AGS和HGC-27，采用CCK-8試驗(yàn)和集落形成試驗(yàn)評估其對細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白表達(dá)以及caspase-3/PARP細(xì)胞凋亡途徑、STAT3、GADD45α和JNK/p38 MAPK信號通路激活情況。結(jié)果：低濃度葫蘆素-I可在不抑制STAT3信號通路的情況下發(fā)揮強(qiáng)大的胃癌細(xì)胞生長抑制作用，此作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素-I可通過上調(diào)GADD45α和激活JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗胃癌作用。結(jié)論：本研究揭示了葫蘆素-I抗胃癌作用的新機(jī)制，證明葫蘆素-I是一個具有臨床應(yīng)用前景的化療藥物。

葫蘆素類； STAT3轉(zhuǎn)錄因子； 生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45α； 絲裂原活化蛋白激酶類； 胃腫瘤； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

Correspondenceto: DENG Chao, Email: denchao1@126.com

Background: Upon inhibition of STAT3 signaling pathway, cucurbitacin-I elicits anticancer effect in various malignancies. However, the anticancer effect and underlying mechanism of cucurbitacin-I in gastric cancer is still elusive.Aims: To explore the effect of low nanomolar cucurbitacin-I on cell proliferation, cell cycle and apoptosis in human gastric cancer cells and the underlying mechanisminvitro.Methods: Human gastric adenocarcinoma cell lines AGS and HGC-27 were treated with cucurbitacin-I at low nanomolar concentration. The anti-proliferative effect of cucurbitacin-I was detected by CCK-8 assay and colony formation assay. Flow cytometry was used to assess the cell cycle and apoptosis.Expressions of cell cycle-related proteins, as well as activation of related pathways such as caspase-3/PARP apoptotic pathway, STAT3, GADD45α and JNK/p38 MAPK signaling pathways were determined by Western blotting.Results: Cucurbitacin-I markedly inhibited the growth of gastric cancer cells at low nanomolar concentration by inducing G2/M phase arrest and apoptosis via a STAT3-independent manner. Furthermore, it was revealed that the anticancer effect of cucurbitacin-I was associated with up-regulation of GADD45α, activation of JNK/p38 MAPK signaling pathway and the subsequent apoptotic events.Conclusions: The present study provides new insights into the mechanism of anticancer effect of cucurbitacin-I, supporting cucurbitacin-I as an attractive therapeutic drug in gastric cancer.

KeywordsCucurbitacins; STAT3 Transcription Factor; Growth Arrest and DNA Damage-Inducible Protein 45alpha; Mitogen-Activated Protein Kinases; Stomach Neoplasms; Cell Cycle; Apoptosis

葫蘆素是一類來源于葫蘆科植物的三萜類化合物，具有抗菌、抗炎、抗糖尿病等多種生物學(xué)活性[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征的差異，葫蘆素可分為12類，其中葫蘆素-B、-D、-E、-I和-Q可發(fā)揮強(qiáng)大的抗癌作用，既往絕大多數(shù)研究表明葫蘆素類藥物的抗癌作用主要是通過抑制STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)的。葫蘆素-I又名JSI-124，作為JAK/STAT3信號通路選擇性抑制劑而得以廣泛應(yīng)用，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部鱗癌、惡性膠質(zhì)瘤等多種STAT3異常激活的惡性腫瘤中發(fā)揮強(qiáng)大的抗癌作用[2-5]。但其在胃癌中是否同樣具有抗癌作用及其作用機(jī)制，目前仍不清楚。本研究旨在評估低濃度葫蘆素-I的抗胃癌作用并初步探討其可能作用機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人胃腺癌細(xì)胞株AGS和HGC-27購自中科院上海細(xì)胞庫，人胃黏膜上皮永生細(xì)胞株GES-1購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，由南京鼓樓醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室凍存。葫蘆素-I(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK、廣譜JNK抑制劑SP600125、p38 MAPK抑制劑SB203580(Selleck Chemicals.)，Lipofectamine?RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific)；CCK-8細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒性檢測試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]，細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences)；試驗(yàn)中所用抗體，包括STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3，磷酸化位點(diǎn)分別為tyr705、ser727)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7(CDK7)、細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)、細(xì)胞分裂周期蛋白2(CDC2)、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、procaspase-3、-8、-9和cleaved caspase-3、-8、-9、生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45α(GADD45α)、JNK和p-JNK、p38 和 p-p38抗體均購自Cell Signaling Technology,Inc.。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：GES-1、AGS和HGC-27細(xì)胞以含 10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基按貼壁方法在37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞接近80%融合狀態(tài)時，以含EDTA的0.25%胰酶消化傳代，2～3 d一次。將對數(shù)生長期細(xì)胞按不同密度接種于6孔板、96孔板或25 cm2細(xì)胞瓶，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. CCK-8試驗(yàn)：于96孔板中每孔加入100 μL含5 000個胃癌細(xì)胞的細(xì)胞懸液，37 ℃孵育過夜，予不同濃度葫蘆素-I處理24 h，以含10% CCK-8的100 μL培養(yǎng)基換液，37 ℃孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值(A值)。每組設(shè)5個復(fù)孔，每次試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。相對細(xì)胞活力=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)。

3. 集落形成試驗(yàn)：于6孔板中每孔鋪1 000個胃癌細(xì)胞，過夜使其貼壁生長，予0、100、200 nmol/L葫蘆素-I處理14 d，期間根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化情況更換培養(yǎng)基。待長成肉眼可見的集落后，1 mL甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，洗凈后于Olympus顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：于6孔板中按相應(yīng)要求處理胃癌細(xì)胞，貼壁細(xì)胞以4 ℃預(yù)冷PBS洗2次，RIPA裂解液冰上裂解，離心、收集上清液，BSA法測定蛋白濃度。以上樣緩沖液調(diào)整各組蛋白至相同濃度，高溫變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜或NC膜，室溫5%脫脂牛奶或5% BSA封閉2 h，根據(jù)試劑說明書稀釋一抗至合適濃度，將膜置于含4 mL抗體稀釋液的塑料盒中，4 ℃孵育過夜，取出條帶，TBST漂洗，加入1∶3 000二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST漂洗，ChemiScope 6000化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)曝光、拍照、分析。

5. 細(xì)胞周期檢測：胃癌細(xì)胞以3×105/孔鋪于6孔板，37 ℃孵育過夜，予不同濃度葫蘆素-I處理12 h，收集貼壁細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，以125 μL溶液A(胰蛋白酶緩沖液)重懸細(xì)胞，輕輕振蕩均勻，室溫反應(yīng)10 min，加入100 μL溶液B(胰蛋白酶抑制劑和RNA酶緩沖液)，輕輕振蕩均勻，室溫反應(yīng)10 min，加入100 μL預(yù)冷溶液C(PI染液)，冰上避光反應(yīng)10 min，于1 h內(nèi)以流式細(xì)胞儀(BD Bio-sciences)分析細(xì)胞周期分布情況。

6. 細(xì)胞凋亡檢測：胃癌細(xì)胞處理同細(xì)胞周期檢測，收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸，分別加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，輕輕振蕩均勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液均勻稀釋，于1 h 內(nèi)以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

7. SiRNA轉(zhuǎn)染：于6孔板中加入0.5 mL Opti-MEMⅠ減血清培養(yǎng)基和50 pmol 相應(yīng)siRNA，再加入7.5 μL Lipofectamine?RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混合均勻，常溫孵育20 min，加入含3×105個胃癌細(xì)胞的2 mL完全培養(yǎng)基懸液，輕輕混合均勻，使siRNA終濃度為20 nmol/L，48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、低濃度葫蘆素-I通過非STAT3信號通路抑制途徑抑制胃癌細(xì)胞生長

CCK-8試驗(yàn)顯示，經(jīng)12.5、25、40、50、100和200 nmol/L 葫蘆素-I處理24 h的AGS和HGC-27細(xì)胞，細(xì)胞活力依次降低，表明葫蘆素-I可劑量依賴性地抑制胃癌細(xì)胞增殖，半數(shù)抑制濃度(IC50)在AGS和HGC-27細(xì)胞中分別約為97.4和123 nmol/L(圖 1A)，低于既往在其他腫瘤細(xì)胞中的報道[2]。進(jìn)一步以100、200 nmol/L葫蘆素-I處理AGS、HGC-27細(xì)胞12 h、24 h、36 h和48 h，發(fā)現(xiàn)處理24 h時幾乎已達(dá)到最大抑制效果(圖1B)。集落形成試驗(yàn)顯示，100、200 nmol/L葫蘆素-I幾乎能完全抑制AGS、HGC-27細(xì)胞的集落形成能力(圖 1C)。因此認(rèn)為低濃度葫蘆素-I能有效抑制胃癌細(xì)胞生長。

既往多數(shù)研究表明葫蘆素-I系通過抑制JAK/STAT3信號通路發(fā)揮抗癌作用。有鑒于此，本研究檢測了人胃黏膜上皮永生細(xì)胞株GES-1和人胃腺癌細(xì)胞株AGS、HGC-27的STAT3基礎(chǔ)激活情況及其在葫蘆素-I處理后的變化。蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，AGS、HGC-27細(xì)胞中STAT3基礎(chǔ)激活明顯高于GES-1細(xì)胞(圖 1D)，而濃度在IC50附近(100 nmol/L)的葫蘆素-I處理24 h對AGS、HGC-27細(xì)胞的STAT3激活無明顯抑制作用(圖 1E)。上述發(fā)現(xiàn)表明葫蘆素-I對胃癌細(xì)胞生長的抑制作用可能不全是通過抑制STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)的。為證明上述結(jié)論，以STAT3-siRNA處理48 h以沉默AGS細(xì)胞中的STAT3基因表達(dá)，CCK-8試驗(yàn)顯示100 nmol/L葫蘆素-I仍能有效抑制AGS細(xì)胞增殖(圖 1F)。綜上，低濃度葫蘆素-I可在不抑制STAT3信號通路的情況下發(fā)揮強(qiáng)大的胃癌細(xì)胞生長抑制作用。

圖1 低濃度葫蘆素-I通過非STAT3信號通路抑制途徑抑制胃癌細(xì)胞生長

二、葫蘆素-I可通過上調(diào)GADD45α誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期檢測顯示，經(jīng)100、200 nmol/L葫蘆素-I處理12 h的AGS和HGC-27細(xì)胞，G2期細(xì)胞比例顯著增加(圖2A)，相應(yīng)地，蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示在G2/M期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用的CDK7、cyclin B1、CDC2蛋白表達(dá)均被葫蘆素-I明顯抑制(圖2B)，提示胃癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期G2/M期阻滯。以100 nmol/L葫蘆素-I處理AGS、HGC-27細(xì)胞1 h時即可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分細(xì)胞變圓、稍發(fā)亮甚至漂浮。上述現(xiàn)象提示葫蘆素-I可能引發(fā)細(xì)胞凋亡事件。細(xì)胞凋亡檢測證實(shí)，經(jīng)100、200 nmol/L葫蘆素-I處理12 h的AGS、HGC-27細(xì)胞發(fā)生明顯的早期和晚期凋亡(圖2C)，同時蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示caspase-3/PARP細(xì)胞凋亡途徑激活(圖2D)。為證明caspase途徑激活在此凋亡事件中居主導(dǎo)地位，以pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK 20 μmol/L預(yù)處理HGC-27細(xì)胞1 h后再進(jìn)行上述檢測，發(fā)現(xiàn)100 nmol/L葫蘆素-I誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯減弱(圖 2E)。

GADD45α是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的一個重要基因，在細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)中起重要作用[6-8]。數(shù)據(jù)庫資料分析顯示，胃癌患者GADD45α mRNA表達(dá)水平明顯低于正常人，高表達(dá)GADD45α mRNA的患者預(yù)后明顯好于低表達(dá)者，提示GADD45α可能在胃癌中起抑癌基因作用。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，100、200 nmol/L葫蘆素-I處理24 h能明顯上調(diào)AGS(p53野生型)、HGC-27(p53突變型)細(xì)胞GADD45α蛋白表達(dá)(圖2F)。為進(jìn)一步證明GADD45α參與介導(dǎo)了葫蘆素-I誘導(dǎo)的G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，以GADD45α-siRNA處理48 h以沉默AGS細(xì)胞中的GADD45α基因表達(dá)，CCK-8試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示100 nmol/L葫蘆素-I誘導(dǎo)G2/M期阻滯和caspase-3/PARP細(xì)胞凋亡途徑激活的能力被抵消，同時被葫蘆素-I抑制的cyclin B1、CDC2蛋白表達(dá)有所增加(圖2G、2H)。綜合上述發(fā)現(xiàn)，葫蘆素-I誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡至少部分是通過上調(diào)GADD45α實(shí)現(xiàn)的。

三、葫蘆素-I可通過激活JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

據(jù)報道，葫蘆素除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，還可通過激活MAPK家族誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，進(jìn)而引起自噬和非凋亡性細(xì)胞死亡[9]。為明確葫蘆素-I在胃癌細(xì)胞中是否亦能激活MAPK家族，本研究以葫蘆素-I處理AGS、HGC-27細(xì)胞后檢測了MAPK家族中兩個關(guān)鍵成員JNK和p38的表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，經(jīng)100、200 nmol/L葫蘆素-I處理 24 h 的AGS和HGC-27細(xì)胞，p-JNK、p-p38表達(dá)明顯上調(diào)(圖3A)，表明葫蘆素-I能激活JNK、p38。為進(jìn)一步證明JNK、p38激活在葫蘆素-I的抗胃癌效應(yīng)中起關(guān)鍵作用，先以廣譜JNK抑制劑SP600125或p38 MAPK抑制劑SB203580 20 μmol/L預(yù)處理AGS細(xì)胞1 h，再予100 nmol/L葫蘆素-I處理，CCK-8試驗(yàn)顯示JNK、p38抑制劑預(yù)處理能明顯減弱葫蘆素-I對胃癌細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞活力顯著升高(圖3B)，細(xì)胞凋亡檢測顯示此種作用正是通過降低葫蘆素-I誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力實(shí)現(xiàn)的(圖3C)，蛋白質(zhì)印跡法檢測證明此時caspase-3/PARP細(xì)胞凋亡途徑激活明顯受抑，但cyclin B1、CDC2蛋白表達(dá)未受明顯影響(圖3D)。綜合上述發(fā)現(xiàn)，葫蘆素-I可通過激活JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

討 論

盡管發(fā)達(dá)國家的胃癌發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢，但胃癌仍是世界范圍內(nèi)，尤其是一些高發(fā)國家如亞太地區(qū)的中國、韓國、日本最常見的惡性腫瘤之一[10-11]。對于已失去手術(shù)機(jī)會的晚期胃癌患者，單用或聯(lián)用目前常用的化療藥物如5-氟尿嘧啶、阿霉素、順鉑等為其主要治療手段之一，然而這些藥物存在低效、高耐藥率等不足[12]。因此，有必要開發(fā)新的、療效更高的胃癌化療藥物。

雖然大多數(shù)研究表明葫蘆素-I的抗癌作用主要是通過抑制STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)的，但本研究發(fā)現(xiàn)低濃度葫蘆素-I在不抑制STAT3信號通路的情況下即可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞生長。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，納摩爾級濃度的葫蘆素-I可通過激活GADD45α和JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

GADD45α是p53信號通路的經(jīng)典效應(yīng)蛋白，參與細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)行為的調(diào)控[6-8]。但GADD45α在胃癌中發(fā)揮何種作用，迄今未見相關(guān)報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)，

圖2 葫蘆素-I可通過上調(diào)GADD45α誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡

葫蘆素-I在胃癌細(xì)胞中可上調(diào)GADD45α表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)葫蘆素-I可激活胃癌細(xì)胞中的JNK/p38 MAPK信號通路，與Zhang等[9]在Hela細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)相一致。既往研究[6-7]發(fā)現(xiàn)GADD45α可通過激活JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。關(guān)于葫蘆素-I在胃癌細(xì)胞中激活這兩條信號通路的分子機(jī)制，以及兩條信號通路間的交互作用，將是本課題組的后續(xù)研究方向。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)葫蘆素-I在較低濃度(對STAT3信號通路無抑制作用)時即可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞生長，發(fā)揮抗癌作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，該作用可能是通過激活GADD45α和JNK/p38 MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)為葫蘆素-I成為抗胃癌治療的新型化療藥物提供了新的理論依據(jù)。

圖3 葫蘆素-I可通過激活JNK/p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

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(2017-03-24收稿；2017-05-18修回)

LowNanomolarCucurbitacin-IInducesG2/MPhaseArrestandApoptosisinGastricCancerCellsandtheUnderlyingMechanism

LIJian1,XIAOXiuling1,LIYan1,ZOUXiaoping2,DENGChao1.

1DepartmentofGastroenterology,thePeople’sHospitalofKaizhouDistrict,Chongqing(405400);2DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.09.003

*Email: 1446894878@qq.com

#本文通信作者，Email: denchao1@126.com