吳陳濤， 金敏敏， 鄧澤融， 段鑫雅, 胡曉斌*

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000)

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是有毒藍(lán)藻產(chǎn)生的代謝物。世界上25%～70%的藍(lán)藻水華污染可產(chǎn)生藻毒素[1]。在已發(fā)現(xiàn)的藻毒素中，微囊藻毒素是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大且造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類(lèi)[2]。其中存在最普遍、含量相對(duì)較多且毒性較大的兩種微囊藻毒素異構(gòu)體為MC-LR、MC-RR(L和R分別代表亮氨酸和精氨酸)[3]。

圖1 微囊藻毒素分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of Microcystins(MCs)

我國(guó)太湖地區(qū)每年藍(lán)藻爆發(fā)時(shí)，水體中的藻毒素以MC-LR 為主[4]。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的飲用水中藻毒素以MC-LR代表的上限值為1.0 μg·L-1[5]。微囊藻毒素的一般結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前，測(cè)定微囊藻毒素的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)[6 - 7]、蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)法[8 - 9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、超高效液相色譜法(UPLC)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[11 - 12]。由于MCs的檢測(cè)對(duì)象通常為環(huán)境樣品，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾大，易產(chǎn)生較高的假陽(yáng)性比率，且蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)和ELISA 法檢測(cè)的均為MC的總量，無(wú)法區(qū)分藻毒素種類(lèi)。近年來(lái)，HPLC和MS聯(lián)用的方法被廣泛用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的藻毒素。與其它方法相比，該方法具有更高的選擇性和靈敏度。本文建立了以固相萃取(SPE)分離富集，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測(cè)水和魚(yú)蝦體內(nèi)的MC-LR和MC-RR的方法，并對(duì)淡水養(yǎng)殖池塘水體和魚(yú)、蝦體內(nèi)的MC-LR和MC-RR進(jìn)行了檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo-Fisher Scientific 公司TSQ-3001型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Waters Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3mL)。Votex-Genie 2旋渦振蕩儀；Sorvall Instruments RC5C高速離心機(jī)；Bandelin Sonoplus HD2070超聲波清洗儀；A11 basic IKA高速粉碎機(jī)；Labconco FreeZone 2.5 L凍干儀；Polytron PT3100勻漿儀；優(yōu)晟USE-24S 24位固相萃取裝置；CM-24型氮吹儀。

MC-LR和MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，純度大于95%。1.0 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取2種微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品于同一容量瓶中，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃避光保存，用時(shí)逐級(jí)稀釋至所需濃度。色譜純甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水由美國(guó)Millipore 公司的Milli-Q凈水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器工作條件

Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18 色譜柱(100×2.1 mm,3.5 μm)；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸乙腈溶液(體積分?jǐn)?shù)，下同)；B為0.1%甲酸的水溶液；流量為0.3 mL·min-1；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。流動(dòng)相梯度為：0～1 min，20%A；1～5 min，80%A；5～12 min，20%A。電離方式為電噴霧電離源(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)量；毛細(xì)管電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度為250 ℃；定量模式為選擇離子監(jiān)測(cè)模式；脫溶劑氣體流量10 L·min-1。測(cè)定MC-LR的質(zhì)譜參數(shù)為：母離子為m/z995.70，定量離子為m/z135.0，錐孔電壓 50 V,保留時(shí)間 0.3 s，碰撞電壓 56.45 V。測(cè)定MC-RR的質(zhì)譜參數(shù)為：母離子為m/z520.0，定量離子為m/z135.0，錐孔電壓 50 V,保留時(shí)間 0.3 s，碰撞電壓 30.25 V。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1水樣中溶解藻毒素的提取將1 000 mL水樣用0.45 μm 的微孔膜過(guò)濾，然后分別用10 mL 甲醇和10 mL 水，以5 mL·min-1活化SPE小柱；將水樣以4 mL·min-1的流速過(guò)柱后，再用5 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫兩次；用氮吹儀將洗脫液濃縮至0.2 mL，并轉(zhuǎn)移到棕色色譜瓶?jī)?nèi)，置于冰柜內(nèi)保存，待上機(jī)分析。

1.3.2魚(yú)、蝦組織中藻毒素的提取(1)提?。簩⒔M織切碎，置于冰柜中預(yù)冷凍，然后用凍干儀凍干；凍干后的組織用高速粉碎機(jī)粉碎。用分析天平稱取凍干粉0.5 g 置于 10 mL 塑料(FEP)離心管中，用移液槍向離心管中加入6 mL 體積比為85% 的甲醇水溶液；將離心管置于冰水浴中，用勻漿機(jī)勻質(zhì)5 min；然后將組織勻漿超聲 15 min。以8 000 r·min-1的速度在-10 ℃下離心10 min，取上清液至50 mL 離心管中；重復(fù)上述85% 甲醇水溶液提取的步驟，合并上清液。(2)除脂：在上清液中加入甲醇飽和的正己烷 10 mL，渦旋30 s，靜置3 min，棄去上層(含脂肪的正己烷層)；重復(fù)此步驟一次[12]。(3)除蛋白質(zhì)：將下層清液用氮吹濃縮至 3 mL，向其中加入10 g·L-1的三氯乙酸溶液 1 mL，搖勻后以8 000 r·min-1離心10 min，取上清液用水稀釋至 10 mL[12]。(4)固相萃取(SPE)過(guò)程：分別用10 mL 甲醇和10 mL 純水以 5 mL·min-1的流速流過(guò)SPE柱，取步驟3得到的10 mL液體上SPE小柱，流速為4 mL·min-1。萃取完畢，用10 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，流速同上；用氮?dú)獯蹈蒘PE小柱 10 min；用5 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫兩次；用氮吹儀將洗脫液濃縮至0.1 mL以下，用甲醇定容至0.2 mL并轉(zhuǎn)移到棕色的色譜進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，待上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了純水、50%、75%、85%甲醇水溶液和純甲醇提取MC-LR和MC-RR的效果(圖2a)。結(jié)果表明：純水和50%甲醇水溶液作為提取劑的提取效率低，可能由于藻毒素分子中有較大的疏水性官能團(tuán)，水的比例太高不利于在含有脂肪成分的組織中提取MCs。當(dāng)用純甲醇作為提取劑時(shí)，基質(zhì)中的脂肪等疏水性成分被提取的比例增加，干擾目標(biāo)物的下一步提取和測(cè)定。結(jié)果表明，85%甲醇溶液比75%甲醇溶液的提取效果好，檢測(cè)時(shí)的干擾峰比采用純甲醇時(shí)低。

為了獲得更高的提取效率，通常需要將生物組織進(jìn)一步破碎勻漿，并采用超聲振蕩使MCs能充分析出。但游離的MCs能與樣品中的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽發(fā)生不可逆的反應(yīng)，過(guò)長(zhǎng)的樣品處理和提取時(shí)間反而會(huì)導(dǎo)致MCs的提取效率下降。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用在冰水浴中，將樣品用勻漿機(jī)勻質(zhì)5 min，方法為每勻質(zhì)5 s 后停 5 s，如此反復(fù)多次；再超聲振蕩 15 min，超聲過(guò)程中每 2 min 渦旋顛倒震蕩一次離心管；然后以8 000 r·min-1的速度離心。重復(fù)提取2次，合并上清液進(jìn)行后續(xù)處理。

2.2 固相萃取的淋洗

一般采用甲醇水溶液作為MCs固相萃取淋洗劑[9,13]。本實(shí)驗(yàn)使用Oasis HLB SPE小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理。MCs易溶于甲醇，同時(shí)，由于MCs 是一種由氨基酸組成的環(huán)肽類(lèi)化合物，因此MCs在水中也有較大的溶解。實(shí)驗(yàn)分別選用0%、5%、10%、20%、30%甲醇水溶液作為淋洗液，收集10 mL淋洗液，氮吹后定容至0.2 mL，上機(jī)分析。結(jié)果表明，隨著甲醇比例的增大，雜質(zhì)去除率上升，但目標(biāo)化合物的損失迅速提高(圖2b)。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選用5%的甲醇水溶液做淋洗液。

2.3 固相萃取柱上MCs的洗脫

以含0.1%三氟乙酸的甲醇為洗脫液，對(duì)洗脫液的用量分別為3、5、8、10、12 mL 時(shí)目標(biāo)物的回收率進(jìn)行了比較(圖2c)。結(jié)果表明，隨著洗脫液用量的增加，目標(biāo)物的回收率增加，當(dāng)洗脫液的用量為8 mL 時(shí)，目標(biāo)物的洗脫率在90%以上，為了保證目標(biāo)物的洗脫完全，本實(shí)驗(yàn)選定洗脫液的用量為10 mL。

2.4 提取液的凈化過(guò)程對(duì)回收率的影響

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇飽和的正己烷去除脂肪，然后用三氯乙酸去除蛋白質(zhì)。圖2d 顯示了魚(yú)肌肉組織提取液去除脂脂肪和蛋白質(zhì)后的藻毒素加標(biāo)回收率與未進(jìn)行這一凈化步驟的提取液中藻毒素加標(biāo)回收率對(duì)比。結(jié)果表明，凈化步驟有利于提高藻毒素的回收率。從另一方面也說(shuō)明了生物組織中大量的基體成分對(duì)藻毒素的測(cè)定有影響。

圖2 藻毒素的提取條件對(duì)其回收率的影響 (a：提取劑對(duì)回收率的影響；b：淋洗液對(duì)回收率的影響；c：洗脫液體積對(duì)回收率的影響；d：凈化過(guò)程對(duì)回收率的影響)Fig.2 The effect of extraction conditions on the recovery rate of MCs(a:extraction solution;b:washing solution;c:eluent volume;c(d):purification step)

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)采用一級(jí)質(zhì)譜定性、二級(jí)質(zhì)譜確認(rèn)定量。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖同水產(chǎn)樣品藻毒素提取純化液對(duì)應(yīng)的MC-LR和MC-RR在保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子和碎片離子上有很好的重現(xiàn)性(圖3)。

圖3 MC-LR 和MC-RR的HPLC-MS/MS譜圖Fig.3 HPLC-MS/MS chromatograms of MC-LR and MC-RR a:1 ng·mL-1 MC-LR in mixed standard;b:1 ng·mL-1 MC-RR in mixed standard;c:MC-LR in spiked sample;d:MC-RR in spiked sample;e:MC-LR not found in real sample;f:MC-RR not found in real sample;g:MC-LR found in real sample;h:MC-RR found in real sample.

分別配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100、250、500 μg·L-1的MC-LR和MC-RR的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,各取10 μL 進(jìn)樣，以樣品濃度(c)為橫坐標(biāo)，樣品峰面積(A)為縱坐標(biāo)，得到MC-LR和MC-RR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.5～500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，MC-LR線性方程為：A=76535.5+5773.5c，R2=0.999；MC-RR線性方程為：A=1.11×106+31535.2c，R2=0.990，均在較寬的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

采用在空白樣品中逐漸降低加標(biāo)濃度的方法確定方法的檢出限，以3倍信噪比、10倍信噪比分別計(jì)算方法的檢出限和定量限。MC-LR和MC-RR的檢出限(LOD)分別為0.05 μg·L-1和0.08 μg·L-1。以信噪比為10倍時(shí)的溶液濃度為定量限，MC-LR和MC-RR定量限(LOQ)分別為0.24 μg·L-1和0.32 μg·L-1，低于世界衛(wèi)生組織推薦的飲用水MC-LR 限量濃度(1.0 μg·L-1)。

在未檢出藻毒素的樣品中分別添加不同濃度水平的MC-LR和MC-RR混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文藻毒素提取方法處理，分別在兩個(gè)不同的加標(biāo)濃度上平行測(cè)定7次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：目標(biāo)化合物在水中的回收率均不低于88.5%，在生物組織中的回收率在63.8%～85.2%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5.2%～9.8%之間，符合對(duì)痕量污染物的檢測(cè)要求。

表1 藻毒素的加標(biāo)回收率(n=7)Table 1 The results of spiked tests(n=7)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)湖州某處的淡水養(yǎng)殖池塘，于2015年6月至12月期間取水樣過(guò)濾后測(cè)定，測(cè)得其MC-LR含量為0～42 μg·L-1，MC-RR含量為0～12 μg·L-1。某蝦塘水中的MC-LR含量為0～117 μg·L-1，MC-RR含量為0～32 μg·L-1。池塘中養(yǎng)殖的花鰱的肝臟組織中檢測(cè)到MC-LR的最高濃度為2.6 μg·kg-1，蝦肉組織中檢測(cè)到MC-LR的最高濃度為4.2 μg·kg-1，絕大部分魚(yú)、蝦樣品中未檢出游離的藻毒素。

3 結(jié)論

建立了SPE分離富集，HPLC-MS/MS法分析水樣及魚(yú)、蝦體內(nèi)痕量微囊藻毒素的方法，對(duì)藻毒素提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法靈敏度高、定性和定量可靠，可用于環(huán)境水樣和生物組織中藻毒素含量的檢測(cè)。對(duì)某淡水養(yǎng)殖池塘的檢測(cè)結(jié)果表明，不同季節(jié)的池塘水中游離的藻毒素含量為0～117 μg·L-1，魚(yú)、蝦組織樣品中為0～4.2 μg·kg-1，絕大部分魚(yú)、蝦體內(nèi)未檢測(cè)到游離的藻毒素。