劉 云， 曹 嵩， 李 科， 李三華， 宋長(zhǎng)偉， 覃 成， 朱欣婷*,4

(1.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000 2.貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000 3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義 563000 4.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000)

雙向電泳技術(shù)(2D)是蛋白組學(xué)研究過(guò)程中的常用技術(shù)，而蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量是做好雙向電泳的前提條件。常用的蛋白質(zhì)定量方法有Bradford法和二辛可寧酸(BCA)法，兩者都是通過(guò)測(cè)定樣品吸光度值進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。但是由于雙向電泳蛋白質(zhì)樣品在制備過(guò)程中會(huì)不可避免的引入硫脲、尿素、SDS、NP-40、Triton X-100等試劑，這些試劑易與Bradford法中的考馬斯亮藍(lán)(CBB)和BCA法中的二辛可寧酸反應(yīng)顯色而影響蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。因此，上述兩種常用的蛋白質(zhì)定量方法不宜應(yīng)用于2D實(shí)驗(yàn)。鑒于此，GE和Bio-Rad公司各自研發(fā)出專屬于2D的蛋白質(zhì)定量試劑盒。但是此類試劑盒價(jià)格昂貴，其售價(jià)為常規(guī)蛋白質(zhì)定量試劑盒的10倍以上，且操作步驟繁瑣、耗時(shí)耗力。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、成本低廉的雙向電泳蛋白質(zhì)定量方法亟待研究人員的關(guān)注。

CBB屬于三苯甲烷類染料。Bradford于1976年發(fā)現(xiàn)CBB-G250(以下簡(jiǎn)稱G250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其最大吸收波長(zhǎng)會(huì)從465 nm轉(zhuǎn)移至595 nm[1]，由此建立了Bradford蛋白質(zhì)定量法，并被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量實(shí)驗(yàn)。CBB常用于聚丙烯酰胺凝膠染色[2 - 4]，也是Blue Native Page(BN-PAGE)電泳技術(shù)中不可或缺的染色劑[5]。Luo等[6]發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE電泳中的蛋白條帶經(jīng)CBB染色后可在近紅外線下發(fā)出熒光。本課題組前期也報(bào)道了一種CBB凝膠染色聯(lián)合近紅外成像用于雙向電泳前的蛋白質(zhì)定量的方法[4]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是試劑兼容性好、定量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是在定量過(guò)程中需要先進(jìn)行凝膠電泳，再染色掃描定量，操作步驟略顯復(fù)雜。

在后續(xù)的研究工作中，本課題組發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)溶液與G250混合后，在近紅外熒光成像系統(tǒng)680 nm波長(zhǎng)下可以被激發(fā)出熒光(發(fā)射波長(zhǎng)720 nm)，其熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度之間具有良好的線性關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在上述蛋白質(zhì)溶液中加入硫脲、尿素等2D樣品制備試劑后，并未影響到這種線性關(guān)系?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本課題組建立了一種基于近紅外成像法以96孔板為載體的蛋白質(zhì)定量方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，既能用于普通蛋白質(zhì)定量實(shí)驗(yàn)，又適用于雙向電泳前蛋白質(zhì)樣品的定量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Li-Cor Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)，Gene公司)。

BSA、硫脲、尿素(美國(guó)，Sigma公司)； G250、CHAPS(美國(guó)，Amresco公司)；DTT、溴酚藍(lán)(美國(guó)，Bio-Rad公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 制備待測(cè)蛋白質(zhì)樣品

以本實(shí)驗(yàn)中雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的制備過(guò)程為例：取含人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)瓶，PBS沖洗3次后胰酶消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。充分吹打后離心(800 r·min-1)，棄上清液。加入3 mL雙向電泳細(xì)胞裂解液(2 mol·L-1硫脲、7 mol·L-1尿素、65 mmol·L-1DTT、4% CHAPS、0.001%溴酚藍(lán))，重懸后冰上超聲破碎，每次超聲運(yùn)行10 s，暫停10 s，計(jì)5個(gè)循環(huán)。14 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min。將上清液分裝后于-80 ℃保存，待測(cè)。

1.3 制備蛋白質(zhì)-G250混合溶液

1.3.1制備模擬2D實(shí)驗(yàn)的2D-BSA-G250溶液用上述雙向電泳細(xì)胞裂解液配制2 mg·mL-1的BSA溶液(2D -BSA溶液)，分別取0、5、15、25、35、50、75、100 μL加入到8支離心管，用超純水補(bǔ)足到1 mL(蛋白終濃度分別為 0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1)。各管中再加入0.01% G250染液(即0.01% (m/V)G -250、4.5%(m/V)乙醇、8.5%(m/V)磷酸，下同) 5 mL，最終總體積為6 mL，充分混勻?yàn)殡p向電泳BSA-G250混合溶液(2D -BSA-G250)。

1.3.2制備普通BSA-G250溶液用超純水配制2 mg·mL-1的BSA溶液，分別取0、5、15、25、35、50、75、100 μL加入到8支離心管，用超純水補(bǔ)足到1 mL(蛋白終濃度分別為 0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1)。各管中再加入0.01%G250染液5 mL，最終總體積為6 mL，充分混勻?yàn)锽SA-G250混合溶液(BSA-G250)。

1.3.3制備待測(cè)蛋白質(zhì)-G250混合溶液按1.2取未知濃度的待測(cè)SGC-7901蛋白質(zhì)樣品50 μL，用超純水補(bǔ)足1 mL，再加入0.01%G250染液5 mL，充分混勻?yàn)殡p向電泳SGC-7901蛋白質(zhì)-G250溶液(2D -SGC-7901-G250)。

1.4 上樣

取96孔板，每孔上樣300 μL蛋白質(zhì)-G250混合溶液(上樣前充分混勻)，具體上樣情況見2.1。

1.5 掃描并框選熒光值

上樣完成后需馬上檢測(cè)。將96孔板置于LI-COR Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。掃描物品選擇microplate 2；focus offset選擇3.5 mm；曝光強(qiáng)度設(shè)為5.0；成像質(zhì)量選擇medium；選擇700 channel(即680 nm波長(zhǎng)通道)；選擇成像區(qū)域后運(yùn)行掃描程序并框選熒光區(qū)域。

1.6 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

統(tǒng)計(jì)各孔熒光強(qiáng)度，以BSA濃度為X軸，吸光度值為Y軸，將熒光強(qiáng)度和各孔BSA蛋白濃度做相關(guān)分析，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

1.7 計(jì)算未知樣品蛋白量

將待測(cè)蛋白樣品孔的熒光值代入回歸方程，即可計(jì)算出待測(cè)蛋白質(zhì)的終濃度。待測(cè)樣品蛋白質(zhì)的濃度(mg·mL-1)=蛋白質(zhì)的終濃度×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描圖像

圖1所示為蛋白質(zhì)-G250染液在680 nm波長(zhǎng)下的掃描圖像。每個(gè)圓圈代表96孔板的一個(gè)孔。大矩形框?yàn)闃?biāo)曲樣品區(qū)：上排為2D -BSA-G250，下排為BSA-G250；兩排樣品從左到右濃度均分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.15、0.2 mg·mL-1；小矩形框中的兩個(gè)孔為測(cè)試區(qū)：左孔為0.05 mg·mL-1的2D -BSA-G250；右孔為0.15 mg·mL-1的BSA-G250。箭頭所指孔為待測(cè)的2D -SGC-7901-G250。由圖1可見染液在近紅外下可被激發(fā)出熒光信號(hào)，其主要原因是CBB在600～800 nm的近紅外熒光波長(zhǎng)下吸收光譜變化不大且信號(hào)相對(duì)較弱，但當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在680 nm左右時(shí)其熒光信號(hào)就會(huì)迅速增大[6]。需要注意的是混合后長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)有聚集現(xiàn)象，因此最好在加樣5 min之內(nèi)就掃描檢測(cè)，以減少誤差。

2.2 熒光值的線性分析

在圖1的基礎(chǔ)上框選熒光值得圖2。圖2中白色圓圈框出的區(qū)域即各孔蛋白質(zhì)-G250混合溶液熒光所在區(qū)域；ID為樣品編號(hào)；數(shù)字代表每個(gè)樣品的熒光值。

圖1 蛋白質(zhì)-G250溶液近紅外熒光成像圖(680 nm 通道)Fig.1 Near-infrared fluorescence imaging of protein-G250 solutions

圖2 蛋白質(zhì)-G250溶液的近紅外熒光成像圖對(duì)應(yīng)的熒光值Fig.2 Near-infrared fluorescence imaging and corresponding fluorescent intensity of protein-G250 solutions

將8個(gè)2D -BSA-G250樣品(大方框，上排)熒光值和對(duì)應(yīng)的BSA蛋白濃度做相關(guān)分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3A)，其回歸方程為：Y=34.23X+0.949,R2=0.986(方程1)。將8個(gè)BSA-G250樣品(大方框，下排)熒光值和對(duì)應(yīng)的BSA蛋白濃度做相關(guān)分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3B)，其回歸方程為：Y=32.89X+1.001，R2=0.987(方程2)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，2D -BSA-G250和BSA-G250樣品的熒光值和蛋白質(zhì)濃度之間均具有良好的線性關(guān)系，因此可以用于雙向電泳蛋白和普通蛋白的定量。

圖3 2D -BSA-G250(A)和BSA-G250(B)的校準(zhǔn)曲線 Fig.3 Calibration curves showing the fluorescent intensity with the increasing concentration of 2D -BSA-G250(A) and BSA-G250(B)

2.3 相對(duì)誤差分析

將17號(hào)蛋白樣品孔(2D -BSA-G250)熒光值2.55代入方程1計(jì)算得蛋白質(zhì)濃度為0.047 mg·mL-1，相對(duì)誤差為6%。將18號(hào)蛋白樣品孔(BSA-G250)的熒光值5.77代入方程2計(jì)算得到蛋白質(zhì)濃度為0.141 mg·mL-1，相對(duì)誤差為6%。定量結(jié)果顯示， 2D -BSA-G250和BSA-G250 兩種樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系，且測(cè)定濃度值與實(shí)際濃度值偏差較小。因此，該方法可以用于包括2D實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的蛋白質(zhì)定量。

2.4 SGC-7901總蛋白質(zhì)定量

將19號(hào)蛋白樣品孔(2D -SGC-7901-G250)的熒光值4.29代入方程1，計(jì)算得細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度為0.098 mg·mL-1，則原液蛋白質(zhì)濃度為0.098×20(稀釋倍數(shù))=1.96 mg·mL-1。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于近紅外成像法以96孔板為載體的蛋白質(zhì)定量方法，與常規(guī)蛋白質(zhì)定量方法比較，該方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：(1)與BCA法相比，不需37 ℃孵育30 min，蛋白質(zhì)-G250混合溶液制備完成后即可上機(jī)掃描，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)化，操作方便。(2)與凝膠染色法相比，省去了SDS-PAGE這一步驟，因此能大幅減少每次定量實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間；此外，以孔板(如96孔板)為載體，一次可檢測(cè)幾十個(gè)樣品，檢測(cè)通量是凝膠染色法的數(shù)倍。(3)與Bradford法相比，可適用于雙向電泳蛋白質(zhì)樣品及某些試劑兼容性較差的蛋白質(zhì)樣品濃度的測(cè)定，建立的方法使用范圍廣，實(shí)用性強(qiáng)。以上所述顯示，本文所建立方法省時(shí)易操作，樣本檢測(cè)通量大，且能排除干擾物影響，可用于雙向電泳在內(nèi)的蛋白質(zhì)樣品的快速定量。