周 均， 粟有志， 李 芳， 辛 芳， 陸 平， 謝麗瓊

(1.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000； 2.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000； 3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046)

圖1 噻氟隆和炔草隆的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of thiazafluron and buturon

噻氟隆(Thiazafluron)又名賽唑隆，化學(xué)名稱為1,3-二甲基-l-(5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)脲，它是一種內(nèi)吸性雜環(huán)脲類除草劑，主要用于去除棉花、玉米耕地中一年生和多年生的單子葉和雙子葉雜草[1]。炔草隆(Buturon)又名播士隆，化學(xué)名稱為1-甲基-l-(1-甲基丙炔-2-基)-3-(4-氯苯基)脲，一種苯基脲除草劑，主要用于農(nóng)作物芽前和苗后的闊葉及一年生雜草的控制[2]。噻氟隆和炔草隆結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，此類除草劑對人類有不同程度的毒性，甚至有致癌作用[3]。目前關(guān)于噻氟隆檢測方法的報道較少，僅見彭興等[4]建立的水果蔬菜中噻氟隆的液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法的定性篩查方法；關(guān)于炔草隆的檢測方法，主要有液相色譜法[5 - 6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7 - 8]、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[9 - 10]。QuEChERS技術(shù)是一種簡單、快速、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，已廣泛用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測[11 - 13]。

本研究采用改進(jìn)的QuEChERS前處理方法，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)建立了同時分析植物源性食品中噻氟隆和炔草隆殘留的方法。該方法簡便快捷，精密度和回收率較好，適用于植物源性食品中噻氟隆和炔草隆殘留的快速確證和定量分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

1260-6460A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；Sigma3-18K臺式冷凍離心機(美國，Sigma公司)；EYELA MMV-1000W振蕩器(日本，東京理化公司)；GM 200刀式混合研磨儀(德國，Retsch公司)；MS3型渦旋振蕩器(德國，IKA公司)。

噻氟隆(純度99%)、炔草隆(純度98.5%)標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙酸乙酯、乙酸、正己烷均為色譜純(德國，Merck公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)粒徑40～60 μm、苯磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)粒徑40～60 μm、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)粒徑70～90 μm(美國Agela公司)；酸性氧化鋁(ALA)、石墨化碳黑(GCB)和C18、氨基(NH2)粉(美國Agilent公司)。實驗用水為MiIIi-Q Advangtage A10 超純水系統(tǒng)(美國，Millipore公司)制備。

分析樣品為實驗室送檢和市售樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取標(biāo)準(zhǔn)品噻氟隆和炔草隆各10 mg(精密稱定)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱中儲存?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：稱取樣品約2.5 g(精密稱定)，按照1.3節(jié)樣品前處理和1.4節(jié)儀器條件進(jìn)行分析，當(dāng)噻氟隆和炔草隆的定性定量離子信噪比均小于3時，樣品確定為空白基質(zhì)；空白基質(zhì)按照1.3節(jié)前處理，獲得基質(zhì)空白提取液，逐步用基質(zhì)空白提取液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至相應(yīng)的工作濃度。

1.3 樣品前處理

白菜、葡萄、西紅柿、黃瓜等新鮮果蔬取其可食部分，切碎混勻，用混合研磨儀制成勻漿備用。葡萄干、枸杞樣品先置于-20 ℃冰箱放置6 h以上，將樣品中水分凍成固態(tài)冰，迅速取出樣品用混合研磨儀加工成粉末狀備用。大米和小麥粉樣品用粉碎機粉碎成粉末狀備用。

葡萄、西紅柿、白菜、蘋果、黃瓜等新鮮果蔬樣品：稱取2.5 g樣品(精確0.01 g)于50 mL具塞離心管，加入5.0 mL酸化乙腈(含0.1%乙酸)，渦旋30 s混勻，加入1.5 g NaCl，震蕩15 min，4 500 r/min離心3 min，取上清液1.0 mL于2 mL具塞離心管，加入吸附劑GCB 25 mg，渦旋30 s，6 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm尼龍膜，濾液待測。枸杞、大米、葡萄干及小麥粉等含水量較少樣品：稱取2.5 g樣品(精確0.01 g)于50 mL具塞離心管，加入5.0 mL超純水浸泡30 min，加入5 mL酸化乙腈，渦旋30 s，加入2.5 g NaCl，震蕩15 min，4 500 r/min離心3 min，取上清液1.0 mL于2 mL具塞離心管，加入吸附劑GCB 25 mg，渦旋30 s，4 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm尼龍膜，濾液待測。

1.4 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：JADE-PAK CB-C18柱(100×2.1 mm,3 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/mL乙酸銨)，流速為0.25 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～1.5 min,0%～65%A;1.5～6.5 min,65%～90%A;6.5～8.5 min,90%A;8.51～10 min,10%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI+)；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：10 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：9 L/min；毛細(xì)管模式電壓4 000 V；監(jiān)測離子對、碰撞能量、碎裂電壓等見表1。

表1 炔草隆和噻氟隆的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions of the pair ion for buturon and thiazafluron

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

分別采用ESI+和ESI-對噻氟隆和炔草隆進(jìn)行母離子掃描，結(jié)果表明兩者均較適合采用ESI+模式，從而確定噻氟隆的[M+H]+為m/z241.1，炔草隆的[M+H]+為m/z237.1。進(jìn)一步對子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得噻氟隆和炔草隆的二級質(zhì)譜全掃描圖見圖2。參照歐盟指令657/2002/EEC決議中有關(guān)規(guī)定，本文選擇離子豐度最高、本底干擾最小的兩個離子對作為特征離子對，其中信號較大的離子對作為定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

圖2 噻氟隆和炔草隆的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of product ion scan for buturon and thiazafluron

液相色譜-質(zhì)譜法分析樣品時，若選擇ESI+模式，在流動相中加入微量的甲酸可提供離子化所需要的H+，微量的乙酸銨可以減少[M+Na]+離子的形成，從而提高監(jiān)測離子的靈敏度。本研究比較了乙腈、甲醇組成的有機相(A相)，以及不同濃度甲酸溶液、乙酸銨溶液、甲酸和乙酸銨混合溶液、純水所組成的無機相(B相)，通過A相與B相的組合比較分析發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)為流動相時，噻氟隆和炔草隆的離子化效率較高。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

圖3 不同提取溶劑對噻氟隆和炔草隆的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of thiazafluron and buturon with different solvents

以枸杞為分析樣品，比較乙腈、酸化乙腈(含0.1%乙酸)、正己烷、乙酸乙酯、丙酮五種提取劑對噻氟隆和炔草隆的提取效果。結(jié)果(圖3)表明：采用丙酮、正己烷、乙酸乙酯作為提取劑時，回收率不能滿足要求；乙腈和酸化乙腈提取時，回收率在85%～100%，均可滿足分析要求。分別以乙腈和酸化乙腈提取空白樣品，獲得空白樣品提取液，以空白樣品提取液稀釋純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，獲得相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，分析樣品基質(zhì)對噻氟隆和炔草隆的影響，結(jié)果表明乙腈提取時噻氟隆和炔草隆的基質(zhì)效應(yīng)分別為66.5%和81.5%；而0.1%乙酸乙腈提取噻氟隆和炔草隆的基質(zhì)效應(yīng)分別為71.7%和86.1%。因此，最終確定酸化乙腈(含0.1%乙酸)作為提取劑。

選擇QuEChERS前處理樣品，常選擇GCB去除花青素、葉綠素等色素化合物，PSA去除有機酸，C18去除脂肪和脂類等非極性有機物。以富含色素的枸杞為分析樣品，比較了PSA、C18、PCX、PEP、NH2、ALA、GCB 7種吸附劑對樣品的凈化效果。結(jié)果表明：C18凈化后，噻氟隆的回收率僅為62%；而其他6種吸附劑凈化后，噻氟隆和炔草隆的回收率均在80%～100%，均可滿足分析方法學(xué)的要求。通過比較不同吸附劑凈化后，噻氟隆和炔草隆的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用GCB凈化后，樣品的基質(zhì)干擾相對較小。同時GCB凈化后，樣品提取液較為清澈。故本文選擇GCB凈化樣品。進(jìn)一步確定GCB的用量。當(dāng)吸附劑用量為25、50、75、100 mg 時，對比噻氟隆和炔草隆的回收率和基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)GCB用量為25～100 mg時，兩者的回收率在91.5%～104.7%范圍，基質(zhì)效應(yīng)為85%～90%，回收率和基質(zhì)效應(yīng)均無明顯差別，考慮節(jié)約成本，最終選擇GCB的用量為25 mg?？瞻阻坭綐悠泛吞砑?倍定量限(LOQ)噻氟隆和炔草隆的空白樣品，經(jīng)提取和凈化后的MRM色譜圖分別見圖4和圖5。

圖4 空白枸杞基質(zhì)中MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of a blank Chinese wolfberry

圖5 空白枸杞中添加1倍LOQ濃度的噻氟隆和炔草隆的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of a negative Chinese wolfberry sample spiked with Buturon and Thiazafluron at 1×LOQ concentration level

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

采用相對響應(yīng)值法[14]，評定噻氟隆和炔草隆的基質(zhì)效應(yīng)(ME)。根據(jù)公式：ME=Am/Ac×100%，其中Am表示空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值；Ac表示純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值。當(dāng)ME在80%～120%之間表明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，但ME在50%～80%和120%～150%之間時，需要考慮如何消除基質(zhì)效應(yīng)。

從表2可知，樣品基質(zhì)對噻氟隆和炔草隆均有抑制效應(yīng)，部分基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。空白樣品按照1.3節(jié)方法處理，獲得基質(zhì)空白提取液，逐步用基質(zhì)空白提取液將噻氟隆標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至0.2、0.4、1.0、2、4、10、20 ng/mL，炔草隆標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至0.5、1、2.5、5、10、25、50 ng/mL。以峰面積(y)對農(nóng)藥質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，噻氟隆和炔草隆的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997。噻氟隆和炔草隆線性范圍、相關(guān)系數(shù)詳見表2。以信噪比(S/N)=3和S/N=10計算檢出限和定量限。噻氟隆的方法檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.4 μg/kg；炔草隆的方法檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

表2 噻氟隆和炔草隆的線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系Table 2 Linear range,matrix effects,linear relationships (r2) of thiazafluron and buturon

y:peak area;x:mass concentration,ng/mL.

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇葡萄、葡萄干、西紅柿、大米、蘋果、枸杞、黃瓜、小麥粉、白菜等空白樣品，以1、2、10倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實驗。所有樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，靜置30 min，待農(nóng)殘被樣品充分吸收后，按照1.3節(jié)方法和1.4節(jié)條件進(jìn)行前處理和儀器測定，每個水平重復(fù)6次。由表3可知：噻氟隆的平均回收率為84.7%～107.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%～16.3%；炔草隆的平均回收率為74.7%～110.0%，RSD為4.3%～12.8%。

表3 噻氟隆和炔草隆的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of thiazafluron and buturon(n=6)

2.5 樣品測定

利用本方法對市售的9種植物源性食品(葡萄、葡萄干、西紅柿、大米、蘋果、枸杞、黃瓜、小麥粉、白菜)共計60余份樣品進(jìn)行噻氟隆和炔草隆殘留量的監(jiān)測分析。結(jié)果均未檢測出目標(biāo)分析物。

3 結(jié)論

本研究以酸化乙腈為提取劑，樣品經(jīng)GCB吸附劑凈化，通過色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了植物源性食品中噻氟隆和炔草隆殘留的檢測方法。該方法簡便快捷、靈敏度高、實用性強，方法學(xué)結(jié)果滿足國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27404-2008)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范-食品理化檢測》的相關(guān)要求，適用于植物源性食品中噻氟隆和炔草隆殘留的快速確證檢測。