李小芳， 馮小強(qiáng)

(天水師范學(xué)院化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅天水 741001)

醫(yī)學(xué)上常以DNA為靶分子來設(shè)計(jì)許多抗癌藥物，且藥物的抗癌活性與其嵌插結(jié)合DNA的能力有關(guān)。因此，研究DNA與小分子之間的鍵合作用，對(duì)設(shè)計(jì)、篩選新型的抗癌新藥具有重要的意義。自從順鉑類抗癌藥物成功應(yīng)用于臨床后，對(duì)結(jié)構(gòu)多樣的金屬配合物的發(fā)光特性、磁性、抑菌活性、抗氧化活性以及與DNA結(jié)合方式的研究頗多。銅是生物體內(nèi)正常的新陳代謝所必須的，具有抗炎殺菌、抗癌抗凝血等功效，是治療許多疾病的一個(gè)主要因素。已報(bào)道了銅配合物和銅鹽的混合物可以有效地抑制癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并且銅配合物的抗癌藥性優(yōu)于順鉑類抗癌藥物[1]。因此，銅配合物的抗癌藥性以及與DNA的作用機(jī)制引起了藥物學(xué)家和生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。

基于銅配合物具有各種重要的生物活性，如抗腫瘤活性、抗菌作用及作為人工核酸酶，煙酸(NA)具有抗腫瘤、抗菌消炎作用和抑制黃嘌呤氧化酶活性，本文以1,10 -鄰菲啰啉(Phen)、NA為配體，合成了三元Cu(Ⅱ) 配合物([Cu(Phen)(NA)]·H2O)，通過紅外光譜、紫外光譜、熱分析和電化學(xué)手段對(duì)配合物進(jìn)行了表征，同時(shí)采用光譜法、循環(huán)伏安法、粘度測(cè)定和DNA變性實(shí)驗(yàn)，研究Cu(Ⅱ)配合物與鯡魚精DNA的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Spectrum One傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)，Perkin Elmere公司)；TG -DTA熱分析儀(美國(guó)，Perkin Elmere公司)；RF-5301PC熒光光譜儀(日本，島津公司)；UV-2450紫外-可見光譜儀(日本，島津公司)；CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

鯡魚精DNA(Sigma公司產(chǎn)品，A260/A280=1.85)，煙酸(NA)(化學(xué)純，天津化學(xué)試劑一廠)，1,10-鄰菲啰啉(Phen)(分析純，上海中秦化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

圖1 NA、phen和配合物的紅外(IR)光譜圖Fig.1 IR spectra of NA,phen and complex

1.2.1配合物的合成在攪拌條件下，將5 mL含16 mg NaOH(0.4 mmol)溶液，加入到含49.6 mg NA的15 mL(0.4 mmol)溶液中，然后加入5 mL含64 mg無水CuSO4(0.4 mmol)溶液，室溫下攪拌30 min后，緩慢滴加15 mL含79.2 mg(0.4 mmol)Phen的無水乙醇溶液，滴加完畢后于50 ℃下反應(yīng)6 h。冷卻至室溫，有深藍(lán)色沉淀析出，抽濾，自然干燥。濾液于室溫下靜止數(shù)周后析出藍(lán)色晶體。配體NA、Phen和配合物的紅外光譜圖如圖1所示：配合物在3 444 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰歸屬為結(jié)晶水。配體NA在1 671 cm-1處的羧羰基特征峰在配合物中消失，而出現(xiàn)了羧酸根1 606 cm-1、1 415 cm-1處的反對(duì)稱和對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，二者差值為191 cm-1，表明羧基以雙齒形式與Cu(Ⅱ)配位[2]；配體Phen的特征吸收峰出現(xiàn)在1 561 cm-1和1 506 cm-1處，形成配合物后特征吸收峰分別移到1 616 cm-1、1 518 cm-1，表明Phen以雙齒螯合形式與Cu(Ⅱ)配位。同時(shí)配合物中還出現(xiàn)配體中沒有的Cu-O和Cu-N的振動(dòng)峰。

紫外光譜表明配體Phen在波長(zhǎng)218 nm和278 nm有兩個(gè)吸收峰，NA在256 nm有π-π*躍遷引起的吸收峰，與Cu(Ⅱ)形成配合物在205 nm、271 nm和293 nm附近出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，并且吸收強(qiáng)度比游離配體的吸收更寬更強(qiáng)，紫外光譜數(shù)據(jù)如表1所示。這可能是由于配合物中芳環(huán)數(shù)目的增多形成了離域的大共軛體系，發(fā)生躍遷的幾率增大所致。紫外光譜表明Phen和NA配體與Cu(Ⅱ)配位形成了新的配合物。

表1 配體、配合物的紫外光譜數(shù)據(jù)Table 1 UV dates of ligands and complex

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10 ℃/min的升溫速度升溫至1 000 ℃，配合物的熱分析(TG -DTG)見圖2。TG曲線在100 ℃之前失重3.4%，表明配合物中存在一分子結(jié)晶水，水分子也參與配位。當(dāng)配合物升溫至200 ℃，對(duì)應(yīng)TG曲線開始明顯下滑,隨著溫度升高，TG曲線在200～500 ℃之間出現(xiàn)了一個(gè)幅度較大失重過程，失重55.6%，是一分子NA的氧化分解。710 ℃附近有一個(gè)熔化的吸熱峰，對(duì)應(yīng)質(zhì)量失重為14.0%，該過程屬于一分子Phen的氧化分解。當(dāng)溫度持續(xù)升高至800 ℃時(shí)，配合物質(zhì)量仍有22.8%的剩余，最終分解產(chǎn)物可能為CuO。結(jié)合TG曲線、紅外、紫外分析手段，初步確定三元銅配合物組成為[Cu(Phen)(NA)]·H2O。

1.2.2配合物與鯡魚精DNA的作用在參比池中加入3 mL的蒸餾水,樣品池中加入3 mL配合物溶液，每次往兩池中同時(shí)加入10 μL的DNA溶液，使DNA濃度逐漸增大?；靹蚍胖?0 min后，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描配合物在加入DNA前后吸收光譜的變化；固定DNA濃度，加入一定濃度的配合物，于20 ℃恒溫作用30 min，測(cè)量流經(jīng)時(shí)間；設(shè)定掃描電位區(qū)間為-1.2～1.0 V，采用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極)，在N2氣氛下測(cè)定配合物在加入DNA前后的循環(huán)伏安曲線；將DNA和不同濃度的配合物溶液混合，從30 ℃到100 ℃恒溫，每隔5 ℃，取出一定量測(cè)定不同溫度下的吸光度(A260 nm)[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜法研究配合物與DNA之間的作用

配合物原位于205、271和293 nm的吸收峰，在加入DNA后均有一定程度的減色，同時(shí)在205 nm處的吸收峰位出現(xiàn)了明顯紅移趨勢(shì)，當(dāng)?shù)渭?20 μL DNA時(shí)，峰位從205 nm紅移至218 nm處，如圖3所示。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，減色效應(yīng)是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜性質(zhì)[4]，當(dāng)在配合物中加入DNA后，其吸收峰強(qiáng)度減少,波長(zhǎng)紅移,說明配合物與DNA之間以嵌插方式相互結(jié)合[5]。

圖2 配合物的TG -DTG -DTAFig.2 TG -DTG -DTA of the complex Test conditions:N2 gas protection,the temperature of 10 ℃/min heating up to 1 000 ℃.

圖3 DNA對(duì)配合物的紫外吸收光譜影響Fig.3 Effect of DNA on the UV spectra of the complex ccomplex=3.5×10-3 mol/L;cDNA=2.0×10-5 mol/L.1-7:volume of DNA was 0,20,40,60,80,100 and 120 μL, respectively.

2.2 熒光光譜法研究配合物與DNA之間的作用

游離態(tài)的中性紅(NR)自身的熒光很弱，但當(dāng)NR分子以嵌插方式與DNA結(jié)合后，體系的熒光強(qiáng)度會(huì)大幅度增強(qiáng)。但是當(dāng)有一個(gè)能取代鍵合NR或能破壞DNA結(jié)構(gòu)的小分子加入時(shí)，NR-DNA體系的熒光則會(huì)發(fā)生猝滅或部分猝滅[7]。實(shí)驗(yàn)以550 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，DNA與NR以濃度比2:1混合時(shí)，測(cè)得DNA-NR體系在596 nm處有一強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，如圖4所示。往DNA-NR體系中逐漸滴加配合物時(shí)，看到在596 nm處的熒光強(qiáng)度會(huì)隨之降低，但峰位并沒有發(fā)生移動(dòng)。說明配合物能夠猝滅DNA-NR體系的熒光，也就是說配合物與DNA之間的作用機(jī)理類似于NR與DNA的作用機(jī)理。配合物和NR在與DNA結(jié)合時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)使得結(jié)合在DNA位點(diǎn)上的NR置換下來，從而溶液中游離的NR數(shù)量增多，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度較DNA-NR減弱。但配合物的濃度增大到一定程度時(shí)，熒光強(qiáng)度下降程度很小，說明此時(shí)配合物與DNA的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，可以推斷出配合物與DNA之間能夠以插入方式發(fā)生鍵合。

2.3 循環(huán)伏安法研究配合物與DNA之間的作用

當(dāng)掃描速率為0.5 V/s時(shí)，在-0.6～1.0 V電位范圍內(nèi)，配合物在0.141 V/-0.205 V出現(xiàn)一對(duì)靈敏的氧化還原峰，對(duì)應(yīng)Cu(Ⅰ)/Cu(Ⅱ)的電子轉(zhuǎn)移。氧化峰電流較靈敏，說明銅在電極表面具有非常大的氧化反應(yīng)速率。當(dāng)改變掃描速度，發(fā)現(xiàn)隨著掃描速度的增大，氧化還原峰電流也隨之增大，氧化峰電位向正方向移動(dòng)，還原峰電位向負(fù)方向移動(dòng)，如圖5所示。通過Ipc-v1/2作圖，發(fā)現(xiàn)氧化峰電流(Ipc)與掃描速

圖4 配合物對(duì)DNA-NR體系的熒光強(qiáng)度影響Fig.4 Effect of the complexes on fluorescence intensity of the DNA-NR system cDNA=2.0×10-5 mol/L;cNR=1.0×10-5 mol/L. 1-10:concentration of complex was 0,0.9,1.8,2.7,3.6,4.5,5.4,6.3,7.2 and 8.1 mol/L, respectively.

圖5 掃描速率對(duì)配合物循環(huán)伏安(CV)曲線的影響Fig.5 Effect of scan rate on the CV curves of the complex ccomplex=3.5×10-3 mol/L;cDNA=2.0×10-5 mol/L. 1-9:scan rate was 0.01,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4 and 0.5 V/s,respectively.

度的平方根(v1/2)之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為：Ipa(10-5A)=0.43-8.23v1/2(R=0.9935)，說明配合物在玻碳電極上的反應(yīng)過程由擴(kuò)散過程控制。

依次用DNA進(jìn)行滴定配合物溶液，每次加入的體積為10 μL，搖勻放置約5 min，配合物與DNA在稀溶液中相互作用的循環(huán)伏安曲線，如圖6所示。在配合物中加入DNA后，氧化還原峰的電流明顯降低，并觀察到配合物在0.208 V(峰電流為-2.61×10-5A)附近的氧化峰有正移趨勢(shì)，但還原峰電位位移不明顯。當(dāng)?shù)渭覦NA體積達(dá)到50 μL時(shí)，配合物的氧化峰正移至0.312 V處，說明式量電位也發(fā)生正移，峰電流降至-1.98×10-5A。這是由于DNA與配合物之間發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致溶液中游離的配合物濃度減小，氧化還原峰電流隨之降低[8]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，如果配合物的式量電位在加入DNA后向正方向偏移，說明兩者發(fā)生了嵌入作用[2]。根據(jù)循環(huán)伏安曲線的變化，再次證明配合物以嵌入方式與DNA作用，形成了非電化學(xué)活性的復(fù)合物。

2.4 熔點(diǎn)法研究配合物與DNA之間的作用

通常將DNA變性，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫度，稱為DNA熔點(diǎn)(Tm)。Tm是使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋一半時(shí)的溫度，是衡量DNA分子穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。一些能作為DNA插入試劑的配合物與DNA作用時(shí)，插入試劑與DNA的堿基對(duì)之間發(fā)生π-π堆積，使DNA的雙螺旋變得穩(wěn)定，DNA的熔點(diǎn)會(huì)明顯升高，而且升高的幅度與結(jié)合強(qiáng)度有關(guān)[9]。配合物對(duì)DNA熔點(diǎn)的影響如圖7所示：配合物與鯡魚精DNA結(jié)合后，DNA的變性溫度升高到78.9 ℃，而單獨(dú)的DNA的正常變性溫度是70 ℃。黎泓波等人[10]發(fā)現(xiàn)血卟啉-DNA體系的Tm為80 ℃，較DNA的正常變性溫度升高10 ℃，認(rèn)為這是因?yàn)檠策度隓NA的堿基對(duì)中，導(dǎo)致DNA穩(wěn)定性升高。圖7說明了配合物能夠嵌入DNA的堿基對(duì)中，使DNA穩(wěn)定性升高。

圖6 配合物與DNA作用的循環(huán)伏安圖Fig.6 The cyclic voltammograms of complex with DNA ccomplex=3.5×10-3 mol/L;cDNA=2.0×10-5 mol/L . 1-8:volume of DNA was 0,10,20,30,40,50,60 and 50 μL,respectively.

圖7 配合物對(duì)DNA變性溫度的影響Fig.7 Influence the complex on DNA melting point ccomplex=3.5×10-3 mol/L;cDNA=2.0×10-5 mol/L.

3 結(jié)論

合成了配合物[Cu(Phen)(NA)]·H2O，該配合物與DNA之間存在嵌入結(jié)合。該研究工作對(duì)診斷并治療與DNA有關(guān)疾病的藥物設(shè)計(jì)提供參考，深入的研究正在進(jìn)行中。