張坤蕾， 李 瑤， 白茹燕， 張 茜， 李德蕾， 胡 蓉， 楊云慧

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明 650500)

C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein,CRP)是機體組織感染、炎癥及受損引起變化而刺激肝細(xì)胞合成的急性相反應(yīng)蛋白，為炎癥的一種敏感性指標(biāo)[1]。CRP正常情況下以微量形式存在于血漿中。當(dāng)機體有炎癥及創(chuàng)傷時，該蛋白含量會明顯升高[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血漿中CRP是動脈粥樣硬化的重要介質(zhì)[3]，也是心血管疾病的有效預(yù)測因素[4]。同時，血清中CRP的含量是監(jiān)控早期心臟受損的一項重要指標(biāo)，是最新發(fā)現(xiàn)的冠心病相關(guān)炎癥因子，在冠心病的診斷過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，臨床上診斷血清中CRP常用的方法有比濁法[5]和免疫濁度法[6]，以及酶聯(lián)免疫吸附、化學(xué)發(fā)光、熒光等方法[7]。這些方法雖然特異性強，但存在如設(shè)備昂貴、操作過程繁瑣、檢測時間長及樣品消耗量大等缺點，且容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此，發(fā)展快速檢測CRP的方法具有重要意義。電化學(xué)免疫傳感器將免疫分析技術(shù)與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，具有成本低、靈敏度高和檢測快速方便等優(yōu)點，受到研究者普遍關(guān)注。

NiS由于具有特殊的光學(xué)、磁學(xué)以及催化性質(zhì)而成為一類重要的半導(dǎo)體納米材料。當(dāng)溫度超過其臨界溫度時，NiS會產(chǎn)生磁性和導(dǎo)電性能的轉(zhuǎn)變[8 - 9]，在光電導(dǎo)材料和鋰電池陰極材料等方面都有著廣泛的應(yīng)用[10]。目前，已合成多種形貌的NiS納米材料，如納米晶、納米棒、三角狀納米棱柱、薄膜以及空心球等[11 - 13]。金納米顆粒(Au NPs)表面活性位點多、吸附力強且非特異性吸附作用小，因此它能與多種生物大分子結(jié)合且不影響其生物活性。NiS納米粒子與Au NPs可形成金硫鍵，起到固定Au NPs的作用，而Au NPs可吸附抗體，從而增加抗體的固定量，并且能增強膜與基體電極結(jié)合的牢固程度。具有響應(yīng)時間短、使用壽命長、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[14]。

本實驗以負(fù)載Au NPs的NiS為固定基底，將CRP抗體固定于玻碳電極(GCE)上，通過二茂鐵甲酸標(biāo)記CRP抗體，構(gòu)建夾心型CRP生物傳感器，實現(xiàn)對CRP的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；采用三電極體系：修飾電極或GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極。ME104E電子分析天平(瑞士,METTLER TOLEDO公司)。

C-反應(yīng)蛋白抗體(anti-CRP)、抗原(CRP)購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；殼聚糖(CHIT)、牛血清白蛋白(BSA)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)，均購于美國Sigma公司；NiCl2·6H2O購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水NaAc、硫代乙酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購于麥克林試劑網(wǎng)；尿素購于美國Amresco公司；乙二醇、無水乙醇、檸檬酸三鈉均購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；二茂鐵甲酸購于北京百靈威科技有限公司；氯金酸購于昆明鉑銳金屬有限公司。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗過程

1.2.1材料的制備球形NiS的制備參考文獻(xiàn)方法[15]：將0.474 g NiCl2·6H2O、1.44 g無水NaAc以及0.15 g硫代乙酰胺依次溶解在20 mL乙二醇中。將此溶液裝入高壓釜中，140 ℃保持8 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)離心分離、乙醇洗滌、干燥，得到的黑色固體即為球狀NiS。

Au NPs參考Frens的方法[16]制備：將50 mL水和500 μL 1%氯金酸溶液裝入圓底燒瓶中，加熱攪拌至沸騰，迅速加入1.75 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱直至溶液變?yōu)榫萍t色。

1.2.2二茂鐵甲酸標(biāo)記anti-CRP將6.0 mg二茂鐵甲酸溶解于1 mL PBS中，調(diào)節(jié)pH至7.3，再加入11 mg NHS和EDC，振搖1 h，離心，棄去上層清液。沉淀用PBS洗滌兩次后，分散于1 mL PBS中，逐滴加入10 μL 1 mg/mL anti-CRP，振搖一夜，于8 000 r/min下離心，即得二茂鐵甲酸標(biāo)記anti-CRP。分散于1 mL PBS中，于冰箱中4 ℃保存，備用。

圖1 免疫傳感器制備流程Fig.1 Flowchart of the immunosensor

1.2.3anti-CRP免疫傳感器的制備將直徑為3 mm 的GCE在砂紙上打磨，在麂皮上用不同粒徑的Al2O3粉末拋光成鏡面后，依次用HNO3(1+1)、乙醇、水各超聲洗滌5 min，晾干。取10 μL 0.5%CHIT滴加到GCE表面，自然晾干。再滴加10 μL NiS溶液，晾干后滴加10 μL Au NPs，晾干，最后滴加CRP抗體，4 ℃過夜干燥。將修飾好的電極用PBS清洗，自然晾干后，用1%BSA于37 ℃下恒溫1 h，以封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點。將不同濃度的CRP抗原滴加于免疫傳感器上，再于37 ℃恒溫培育40 min，用PBS沖洗。然后滴加10 μL的二茂鐵甲酸標(biāo)記的CRP抗體，恒溫培育50 min。免疫傳感器制備流程如圖1所示。

1.2.4檢測方法在10 mL 0.1 mol/L PBS中，以該傳感器為工作電極，在 0.1～0.5 V范圍內(nèi)，采用差分脈沖伏安法(DPV)測定。測量條件：振幅50 mV，脈沖寬度0.05 s，脈沖周期0.1 s。根據(jù)該傳感器在0.3 V左右的電流值與樣品中CRP濃度成正比的關(guān)系，實現(xiàn)對CRP的定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

對所合成的NiS進(jìn)行X-射線粉末衍射(XRD)分析，結(jié)果見圖2。從圖可看出，譜峰分別出現(xiàn)在2θ為30.1°、34.6°、45.8°、53.6°和65.5°左右，與文獻(xiàn)報道[15]對應(yīng)一致，表明產(chǎn)物為NiS。

取少量NiS超聲分散在無水乙醇中，用透射電鏡(TEM)觀察其形貌(圖3)，可知所制備的NiS形貌呈類球形，粒徑約200～300 nm。

2.2 免疫傳感器的電化學(xué)行為

圖4為Labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE在10 mL 0.01 mol/L PBS (pH=7.4)中的循環(huán)伏安圖?？梢钥闯?，當(dāng)掃描速度在20～100 mV/s 變化時，峰電流的絕對值與掃描速度的平方根成正比，ipc=-11.17+2.49v1/2；ipa=5.73-1.81v1/2，說明該電流受擴散速度控制。

圖5為不同電極在5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗(EIS)曲線。曲線a為裸GCE的交流阻抗，曲線b為滴加了CHIT的GCE交流阻抗，曲線c為固定NiS之后GCE的交流阻抗，Au/NiS/CHIT/GCE的交流阻抗為曲線d。由圖5可知，滴加CRP抗體之后由于抗體阻礙了電子在電極表面的傳遞，使阻抗增加(曲線e);當(dāng)用1%BSA封閉后滴加CRP抗原，由于抗原抗體結(jié)合形成了蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)一步阻礙了電子在電極表面的傳遞(曲線f)；滴加二茂鐵甲酸標(biāo)記抗體之后，抗原和標(biāo)記抗體結(jié)合形成了復(fù)合物使阻抗進(jìn)一步增加(曲線g)。

圖2 NiS的X-射線衍射(XRD)圖Fig.2 XRD of NiS

圖3 NiS的透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM image of NiS

圖4 免疫傳感器于不同掃速條件下的循環(huán)伏安圖(內(nèi)置圖為峰電流對掃描速率平方根的線性圖)Fig.4 Cyclic voltammograms of the labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE at various scan rates(Inset:the plot of peak current vs v1/2) a:20 mV/s,b:40 mV/s,c:60 mV/s,d:80 mV/s,e:100 mV/s.

圖5 不同電極在5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗譜圖Fig.5 Nyquist plots of impedance spectra by using different electrodes in 5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4- solution(a):bare GCE;(b):CHIT/GCE;(c):NiS/CHIT/GCE;(d):Au/NiS/CHIT/GCE;(e):anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE;(f):CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE;(g):Labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE.

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1溶液pH對免疫傳感器的影響溶液pH值不僅影響抗原、抗體的活性，還影響蛋白質(zhì)在電極表面的親和性?？疾炝巳芤旱膒H值對DPV峰電流的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，在pH為7.3時，峰電流信號最大，實驗選擇的最佳pH值為7.3。

2.3.2固定抗體濃度對免疫傳感器的影響實驗考察了固定抗體濃度對免疫傳感器的影響。由圖7可知，當(dāng)培育的CRP抗原濃度保持在20 ng/mL時，逐步增加固定抗體濃度，電極響應(yīng)電流增大，當(dāng)抗體濃度為40 μg/mL時傳感器的響應(yīng)電流最大，當(dāng)固定抗體濃度大于40 μg/mL時，傳感器的響應(yīng)電流有所下降。實驗選擇40 μg/mL作為最佳固定抗體濃度。

圖6 pH值對免疫傳感器響應(yīng)性能的影響Fig.6 Effect of pH on the response of immunosensor

圖7 固定抗體濃度對免疫傳感器的影響Fig.7 Effect of immobilized anti-CRP concentration on the response of immunosensor

2.3.3抗原培育時間對傳感器電流的影響在37 ℃的培育條件下，當(dāng)固定抗體濃度為40 μg/mL而抗原濃度為20 ng/mL時，通過DPV法分別測定不同抗原培育時間下的免疫傳感器的響應(yīng)電流，結(jié)果表明響應(yīng)電流隨著時間的增大，先增加后減小。當(dāng)培育時間為40 min時，響應(yīng)電流最大，因此，選擇40 min為最佳抗原培育時間。

2.3.4標(biāo)記抗體培育時間對免疫傳感器的影響固定抗原濃度、抗體濃度和抗原培育時間不變，通過DPV法分別測定不同標(biāo)記抗體培育時間(10～60 min)對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響。結(jié)果表明，隨著標(biāo)記抗體培育時間的增加，電流逐漸增大。當(dāng)標(biāo)記抗體培育時間為50 min時，傳感器響應(yīng)電流最大。因此，選擇50 min作為最佳標(biāo)記抗體培育時間。

2.4 CRP免疫傳感器的響應(yīng)性能

在優(yōu)化實驗條件下，測得傳感器對不同濃度CRP響應(yīng)的工作曲線，如圖8所示。傳感器在0.01～500 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，線性方程為：I=0.0224c+1.4515，相關(guān)系數(shù)R2=0.9939，CRP的檢測限為3.3 pg/mL。該結(jié)果比Kokkinos等[17]報道的檢測限低。

2.5 免疫傳感器的選擇性

選擇性是考察傳感器生物分子識別特異性的有利判據(jù)。本實驗考察了CRP傳感器的選擇性。在最優(yōu)條件下，考察了4種可能的干擾物對傳感器的影響。分別將40 ng/mL CEA、40 ng/mL谷氨酸(Glu)、40 ng/mL甘氨酸(Gly)、1%的BSA等干擾物質(zhì)與20 ng/mL的CRP抗原按體積比1∶1混合，進(jìn)行干擾試驗。結(jié)果如圖9所示，幾種條件下電流值基本相同，說明這幾種干擾物不影響傳感器的測定，由此可看出此傳感器具有良好的選擇性。

圖8 免疫傳感器的校正曲線(內(nèi)置圖為免疫傳感器對不同濃度CRP的DPV響應(yīng))Fig.8 The calibration curve of immunosensor(Inset:The DPV response of immunosensor to different concentration of CRP) a-i:500,450,360,260,160,100,50,1,0.01 ng/mL,respectively.

圖9 免疫傳感器的選擇性Fig.9 The selectivity of the electrochemical immunosensors

2.6 回收率的測定

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在稀釋的血清中加入3種不用濃度的CRP抗原，每個濃度平行測量3次，結(jié)果見表1。檢測平均回收率為98.1%，說明該傳感器可以用于實際樣品中CRP含量的檢測。

表1 CRP回收率的測定(n=3)Table 1 The recovery of immunosensor(n=3)

2.7 傳感器的再生

測定完畢，用0.01 moL/L PBS 洗滌傳感器，然后放在4.0 moL/L的尿素溶液中攪拌洗脫30 min，使免疫復(fù)合物解離，從而使電極得到再生。

2.8 傳感器的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性

同一傳感器平行測定3次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.41%，說明傳感器具有較好的重現(xiàn)性。將該傳感器放置一周后測定，電流為原來的97.02%。放置36 d后電流保持原來的 84.7%，表明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本實驗利用NiS與Au NPs將CRP抗體固定于玻碳電極上，通過二茂鐵甲酸標(biāo)記CRP抗體，構(gòu)建夾心型CRP生物傳感器實現(xiàn)對抗原的定量檢測。該傳感器具有較寬的線性范圍，較低的檢測限，為CRP的檢測提供了一種新的技術(shù)。