劉 歡, 胡亞萍, 高習(xí)習(xí), 王 鵬, 丁 凡, 王欽富

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116622)

堿性磷酸酶(Alkaline Phosphates,ALP)是一種廣泛存在于人體、動物、植物及微生物體內(nèi)的膜結(jié)合蛋白，在堿性條件下具有催化活性。ALP直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝等生理過程，對體內(nèi)鈣磷的吸收與代謝、維持體內(nèi)適宜鈣磷比例，以及動物的骨化過程有著極其重要的作用[1]。血清中的ALP活力增高可見于阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸型肝炎、肝癌等肝膽疾病，因此ALP酶活力測定常作為肝膽疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。另外，ALP是乳中天然存在的一種酶，該酶作為一種熱處理強(qiáng)度指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于評價(jià)牛奶巴氏殺菌是否徹底[2]。

目前，檢測ALP的主要方法有電化學(xué)法[3 - 4]、熒光分光光度法[5 - 7]、紫外-可見分光光度法[8 - 9]、化學(xué)發(fā)光法[10 - 12]等。電化學(xué)法是以磷酸苯酯為底物，通過TYR和電活性產(chǎn)物之間能夠進(jìn)行反復(fù)連續(xù)的反應(yīng)，化學(xué)反應(yīng)信號得到增強(qiáng)，從而測定ALP活性。該方法較為快捷方便，但是選擇性較差，反應(yīng)條件不易控制。熒光分光光度法采用的是動力學(xué)連續(xù)性檢測，在作用時(shí)間內(nèi)對產(chǎn)生的熒光增加量與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計(jì)算相應(yīng)的酶活力，方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高，但用時(shí)較長，不易測量。紫外-可見分光光度法是在堿性磷酸酶的催化作用下，生成一種藍(lán)色的化合物靛酚，通過與一套標(biāo)準(zhǔn)顏色進(jìn)行對比或者用分光光度計(jì)檢測，得出ALP的活性。雖然這種方法快速、方便，但苯酚極易受到污染，造成假陽性結(jié)果，且結(jié)果判斷具有主觀性，影響測定準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)采用的化學(xué)發(fā)光法是利用發(fā)光底物APLS能被ALP迅速水解，且水解產(chǎn)物能夠持續(xù)發(fā)光，通過多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強(qiáng)度，以測定ALP活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

pH計(jì)(上海天達(dá)公司)；生化培養(yǎng)箱(Bluepard 公司)；Synergy2多功能酶標(biāo)儀(BioTek 公司)。

ALP標(biāo)準(zhǔn)品(Sangon Biotech 公司)酶活力是5 000 U/mg；ALP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，1 mmol/L MgCl2，50%甘油。APLS底物液(InnosepBio 公司)；白色96孔微孔板(Mabtech 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

微孔板化學(xué)發(fā)光法檢測ALP的操作步驟是在白色96孔微孔板中加入ALP及其底物APLS，孵育后，用多功能酶標(biāo)儀檢測其發(fā)光強(qiáng)度，進(jìn)而測量ALP的活性(△RLU)。僅加入APLS底物的發(fā)光光子數(shù)為RLU0，ALP作用產(chǎn)生發(fā)光光子數(shù)為RLU,△RLU=RLU-RLU0。

2 結(jié)果與分析

2.1 孵育溫度對化學(xué)發(fā)光體系的影響

1 U/L ALP標(biāo)準(zhǔn)品與200 μL、pH=9.5的APLS底物液在溫度分別為27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃下孵育10 min后，體系的△RLU與溫度的關(guān)系見圖1?？梢娫?7 ℃處達(dá)到峰值。因此，ALP最適反應(yīng)溫度為37 ℃。

2.2 APLS底物液體積對化學(xué)發(fā)光體系的影響

1 U/L ALP標(biāo)準(zhǔn)品與pH=9.5、體積分別為25、50、100、150、200 μL的APLS底物液，在37 ℃條件下孵育10 min，體系的△RLU與APLS底物液體積的關(guān)系見圖2。結(jié)果表明△RLU隨APLS底物液體積增大而增大，當(dāng)體積大于200 μL時(shí)，△RLU達(dá)到平臺，因此，最適APLS底物液體積為200 μL。

2.3 pH對化學(xué)發(fā)光體系的影響

1 U/L ALP標(biāo)準(zhǔn)品與200 μL、pH分別為8、8.5、9、9.2、9.5、10、11的APLS底物液，在37 ℃條件下孵育10 min，其發(fā)△RLU與pH的關(guān)系見圖3，結(jié)果顯示在pH=9.5時(shí)，△RLU最大。因此，APLS法檢測ALP反應(yīng)體系的最適pH值為9.5。

2.4 孵育時(shí)間對化學(xué)發(fā)光體系的影響

在酶促反應(yīng)中，孵育時(shí)間對ALP催化底物APLS的水解反應(yīng)速度影響很大。從圖4中可以看出，△RLU在孵育2、10、20、30、40、50、60 min等不同時(shí)間點(diǎn)檢測時(shí)呈現(xiàn)曲線關(guān)系，當(dāng)時(shí)間為10 min時(shí)，△RLU最大。因此，ALP與底物APLS的最佳反應(yīng)時(shí)間是10 min。與趙啟仁等[11]發(fā)光法檢測ALP和茹柿平等[2]電化學(xué)法檢測ALP的時(shí)間為20 min相比，本文建立的化學(xué)發(fā)光法所用時(shí)間縮短。

圖1 溫度對于反應(yīng)體系的△RLU的影響Fig.1 Effect of temperature on △RLU of reaction system

圖2 APLS底物體積對反應(yīng)體系△RLU的影響Fig.2 Effect of APLS volume on △RLU of reaction system

圖3 pH對反應(yīng)體系△RLU的影響Fig.3 Effect of pH on △RLU of reaction system

圖4 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)體系的△RLU的影響Fig.4 Effect of incubation time on △RLU of reaction system

2.5 靈敏度和線性范圍

0.0001～1 000 U/L 不同酶活力的ALP 與pH=9.5、200 μL APLS底物在37 ℃條件下孵育10 min。微孔板化學(xué)發(fā)光法檢測，ALP酶活力在0.01～1 U/L范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：△RLU=7.1478x+0.25857,相關(guān)系數(shù)為0.9918。

3 結(jié)論

本文利用一種新的發(fā)光底物APLS，建立微孔板化學(xué)發(fā)光法檢測ALP并進(jìn)行條件優(yōu)化。優(yōu)化最適反應(yīng)條件為：微孔板上每孔加200 μL APLS，在pH=9.5、37 ℃條件下與待測ALP反應(yīng)10 min。結(jié)果表明檢測ALP線性范圍是0.01～1 U/L，相對于光吸收法等本文方法靈敏度更高，且操作簡便易行。