陳祥準(zhǔn)， 李 舟， 黃芙珍， 朱振甌， 劉 濱， 韓 超

(溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江溫州 325027)

圖1 化合物OTA(A)和OTB(B)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of OTA(A) and OTB(B)

赭曲霉毒素(Ochratoxin，OT)是由曲霉和青霉屬產(chǎn)毒菌株的次級代謝產(chǎn)物，包含7種結(jié)構(gòu)類似化合物[1 - 2]。其中赭曲霉毒素A(OTA) 毒性最大，對農(nóng)作物的污染最重，分布最廣[3 - 4]。毒理學(xué)研究表明OTA具有腎臟毒性，肝臟毒性、以及致畸、致癌和致突變作用等多種毒性[5 - 7]。食品與飼料中常伴隨存在一種無氯的OTA結(jié)構(gòu)類似物赭曲霉毒素B(OTB)。OTB的分子結(jié)構(gòu)相對OTA沒有氯元素(圖1)，也通常存在于谷物與食品中，其危害低于OTA。

溫州是全球重要的寵物食品加工基地，為了提高出口寵物食品的安全質(zhì)量，因此，對寵物食品中OTA和OTB的殘留檢測具有重要意義。目前針對OTA的檢測方法有液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8 - 9]、化學(xué)發(fā)光法[10 - 11]、電化學(xué)方法[12]、Elisa法[13]，研究對象也主要集中在OTA上，對OTB的研究較少。本研究用乙腈/水(1∶1,V/V)超聲提取樣品，固相萃取柱凈化后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，建立了同時(shí)測定寵物食品中OTA和OTB的分析方法。方法靈敏度高，適用性強(qiáng)，定性定量準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1200高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；P300H超聲波清洗器(德國，Elma公司)；Milli-Q超純水器((美國，Millipore公司)。HLB強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱(60 mg/3mL,Waters公司)。

1.2 材料與試劑

赭曲霉毒素A(純度99.4%,CAS No.303-47-9)和赭曲霉毒素B(純度99.4%,CAS No.4825-86-9)購自百靈威公司。甲醇、乙腈均為色譜純(德國MERCK公司)；甲酸銨、乙酸銨(美國Alfa Aesar公司)；其他試劑未說明均為分析純。

寵物食品樣品來自客戶委托檢測樣品。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

Agilent ZOBRAX C18柱(150×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：B相在0～2 min，從30%變化到90%后保持10 min；流速：250 μL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL，柱溫30 ℃。

電噴霧離子源：正離子掃描；離子源溫度450 ℃；電噴霧電壓4 500 V；霧化氣(GS1) 壓力344.5 kPa；輔助氣流速(GS2) 275.6 kPa；氣簾氣壓力68.9 kPa；碰撞氣(CAD)137.8 kPa。監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 化合物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

aquantification ion.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取OTA和OTB標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用前根據(jù)實(shí)際需要，將儲備液用甲醇稀釋至適宜含量，配制成100 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；|(zhì)校準(zhǔn)工作溶液制備：選取空白樣品6份，按照“1.5”節(jié)方法進(jìn)行樣品處理，氮吹至約0.5 mL，依次加入5、25、50、100、250、500 μL的100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再用甲醇稀釋至5 mL，即得濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng·mL-1的基質(zhì)校準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品處理與凈化

稱取混合均勻?qū)櫸锸称窐悠?.00 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈/水(1∶1,V/V)溶液提取，漩渦振蕩2 min，超聲提取30 min，于4 000 r·min-1離心5 min，過濾并用提取溶劑定容到25 mL 容量瓶中，待凈化。由待凈化液中準(zhǔn)確移取5 mL提取液，加入5 mL純水混勻，使該樣液通過HLB固相萃取柱，樣液全部流出后，先用5 mL水和5 mL 30%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，負(fù)壓抽干，最后用5 mL甲醇洗脫，洗脫液在40 ℃用氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容? mL后，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將標(biāo)準(zhǔn)品配制成200 ng·mL-1溶液，通過流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，調(diào)諧質(zhì)譜參數(shù)。結(jié)果表明：在ESI源的正離子模式下，OTA和OTB呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，準(zhǔn)分子離子[M+H]+是響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子。在確定母離子后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1，二級質(zhì)譜圖見圖1。

圖2 OTA(A)和OTB(B)的二級質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS/MS spectra of OTA(A) and OTB(B)

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

為了優(yōu)化色譜分離，分別考察了不同色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)、Waters X Bridge TM C18柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 mm)、Waters Xselect TM HSS T3柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱相較于其他色譜柱在同等情況下分離效果最佳。為了提高靈敏度，試驗(yàn)了流動(dòng)相中分別添加甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相添加0.1%甲酸化合物具有最佳響應(yīng)值，獲得較好的色譜峰形，其MRM色譜圖見圖2。

2.3 提取溶劑和固相萃取柱的選擇

分別對空白寵物食品樣品進(jìn)行濃度為1.0 μg·kg-1的回收率實(shí)驗(yàn)，考察了不同溶劑(甲醇、乙腈/水和乙腈)的提取回收率。結(jié)果表明乙腈/水(1∶1,V/V)提取效率和乙腈相近(80%～91%)，略高于甲醇的提取效率(76%～87%)，且有機(jī)溶劑消耗較少，故采用乙腈/水(1∶1,V/V)作為提取溶劑。

分別考察了不同固相萃取柱Waters Oasis HLB，Waters Oasis MCX，Superclean ENVI C18對加標(biāo)為1.0 μg·kg-1樣品的萃取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLB固相萃取小柱的凈化效果較好，其加標(biāo)回收率為78%～92%。

2.4 方法的線性范圍與相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)，空白樣品按照1.5節(jié)前處理，配制一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的實(shí)驗(yàn)條件測定。結(jié)果表明，OTA和OTB在0.1～10.0 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性，所得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算該方法定量限(LOQ)，這2種待測物的定量限分別為0.1 μg·kg-1和0.05 μg·kg-1。

表2 OTA和OTB的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限

arefercnces report.

2.5 加標(biāo)回收率

取已知空白樣品進(jìn)行濃度分別為0.1、0.5、2.0 μg·kg-1的OTA和OTB加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。OTA和OTB標(biāo)準(zhǔn)的MRM色譜圖見圖3。空白樣品加標(biāo)MRM圖譜見圖4。

表3 寵物食品中OTA和OTB加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖3 OTA和OTB標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng·mL-1)的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of standards(1.0 ng·mL-1)

圖4 空白樣品加標(biāo)0.5 μg·kg-1的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of blank sample spiked with 0.5 μg·kg-1 standards

2.6 實(shí)際樣品測定

對客戶委托的二十種寵物樣品按本方法進(jìn)行了OTA和OTB含量測定，均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定寵物食品中赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B的分析方法。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于寵物食品中赭曲霉毒素A和B的測定。