范麗麗， 王 娟， 吳加倫

(農(nóng)業(yè)部植物病原及昆蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州 310058)

嘧菌酯(Azoxystrobin)是先正達(dá)公司開發(fā)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn)，對(duì)白粉病、霜霉病等數(shù)十種真菌性病害均有良好的活性[1]。嘧菌酯與目前已有的其他類別殺菌劑無交互抗性，近年來已發(fā)展為極具潛力和市場(chǎng)活力的新型農(nóng)用殺菌劑[2]。

鐵皮石斛、浙貝母和人參均收錄于歷版《中國(guó)藥典》一部[3]中，具有獨(dú)特的療效，在人類健康上起到很重要的作用。姚曉明等[4]針對(duì)浙江省中藥材的農(nóng)藥使用情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其農(nóng)藥品種高達(dá)80多種，其中嘧菌酯是檢出率較高的農(nóng)藥之一，因此嘧菌酯在中藥材中的殘留成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)問題。目前，國(guó)內(nèi)外已有較多有關(guān)嘧菌酯殘留檢測(cè)的報(bào)道，但主要是針對(duì)水果、蔬菜以及糧食作物等基質(zhì)[5,10]，而關(guān)于中藥材中嘧菌酯殘留的研究較少，僅有人參的相關(guān)報(bào)道[11 - 12]。本研究旨在建立鐵皮石斛、浙貝母和人參中嘧菌酯的氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)殘留分析方法，在易于操作和適用的基礎(chǔ)上均滿足殘留分析的要求，同時(shí)更好的保障中藥材的食用安全，促進(jìn)其國(guó)際化貿(mào)易。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

7890A氣相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，配電子捕獲檢測(cè)器(ECD)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-III-B循環(huán)水式抽濾裝置(杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)；Heidolph Laborota 4010 digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)，Heidolph集團(tuán))；MNT-5800氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

嘧菌酯(Azoxystrobin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%，迪馬科技有限公司)。準(zhǔn)確稱取嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品0.0101 g(精確到0.0001 g)，用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，保存于-20 ℃冰箱中，實(shí)驗(yàn)時(shí)用乙酸乙酯稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冰箱保存，備用。乙腈、二氯甲烷、正己烷、NaCl、無水Na2SO4均為分析純；乙酸乙酯為色譜純，用前經(jīng)過全玻璃蒸餾裝置重蒸；弗羅里硅土(粒徑150～250 μm，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，中性Al2O3(粒徑75～150 μm，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，兩者均經(jīng)600 ℃灼燒4 h，用前于130 ℃烘2 h后，加3%的水脫活；活性炭(分析純，濃HCl中加熱煮沸1 h，用水洗至中性，烘干后在600 ℃灼燒2 h)。

鐵皮石斛樣品購(gòu)于浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司(經(jīng)檢測(cè)不含嘧菌酯)；人參及浙貝母樣品購(gòu)于浙江省磐安藥材市場(chǎng)(經(jīng)檢測(cè)不含嘧菌酯)，樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎、混勻，裝入聚乙烯塑料袋，于-20 ℃貯存，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取稱取已粉碎的干中藥材粉末5.00 g(鐵皮石斛干粉2.00 g)，精確至0.01 g，置于250 mL帶螺紋蓋樣品瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL水，搖勻后旋緊螺紋蓋，靜置10 min后，再加入50 mL乙腈，超聲提取30 min，提取液經(jīng)布氏漏斗抽濾，并用30 mL乙腈洗滌殘?jiān)喜V液于平底燒瓶中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。將濃縮液轉(zhuǎn)移到盛有50 mL 10%的NaCl溶液的250 mL分液漏斗中，分別用40 mL二氯甲烷振蕩萃取兩次，經(jīng)無水Na2SO4脫水后收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，氮吹儀吹干，5 mL正己烷溶解，待層析柱凈化。

1.2.2凈化層析柱從下往上依次是2 cm無水Na2SO4，1 g弗羅里硅土，5 g中性Al2O3混合物(鐵皮石斛樣品需再加入0.1 g活性炭)，2 cm無水Na2SO4，均勻敲實(shí)。首先用15 mL的二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)和15 mL二氯甲烷預(yù)淋洗，待液面接近上層無水Na2SO4底部時(shí)，立刻加入上述溶解液，再依次加入20 mL正己烷、30 mL二氯甲烷淋洗，均棄去以上淋出液，最后用80 mL二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V) 混合溶液洗脫，收集全部洗脫液于250 mL平底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，氮吹儀吹干，乙酸乙酯定容至5 mL(鐵皮石斛定容至2 mL)，過0.22 μm濾膜，待GC-ECD檢測(cè)。

1.3 氣相色譜條件

色譜柱為DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent Technologies SN123-5032)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；檢測(cè)器溫度325 ℃；程序升溫:初始100 ℃保持1 min，以50 ℃/min升至200 ℃保持1 min，再以25 ℃/min升至270 ℃保持3 min，最后以再以5 ℃/min升至290 ℃保持15 min；載氣為高純氮?dú)?，流?.0 mL/min；尾吹氣流量30.0 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣。采用保留時(shí)間定性，基質(zhì)外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法的選擇

嘧菌酯的殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[5 - 6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8 - 9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12]。采用GC-MS和LC-MS/MS等檢測(cè)方法雖然既可定性又可定量，但儀器昂貴，不利于方法的推廣使用。而GC-ECD作為嘧菌酯常用的檢測(cè)手段，儀器成本低，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，是一種可以被廣泛推廣的檢測(cè)手段。且從三種中藥材樣品色譜圖(圖1)可以看出，目標(biāo)峰與雜質(zhì)完全分離，不影響其定性分析的準(zhǔn)確性，其檢測(cè)靈敏度高，穩(wěn)定性好，故本研究選用GC-ECD法進(jìn)行嘧菌酯的檢測(cè)。

圖1 嘧菌酯在不同基質(zhì)中的色譜圖Fig.1 Chromatograms of azoxystrobin in different matrices A:Chromatograms of ethyl acetate(a) and 0.1 mg/kg standard solution of azoxystrobin(b);B:Blank fritillaria thunbergii sample(a) and spiked fritillaria thunbergii sample at 0.1 mg/kg(b);C:Blank dendrobium candidum sample(a) and spiked dendrobium candidum sample at 0.1 mg/kg(b);D:Blank panax ginseng sample(a) and spiked panax ginsengsample at 0.1 mg/kg(b).

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇基于嘧菌酯的在各種溶劑中的溶解度[1]，本研究比較了乙腈、丙酮兩種溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者回收率均在80%以上，其中丙酮的提取回收率相對(duì)較高，但同時(shí)提取出色素等多種雜質(zhì)，給后續(xù)凈化增加難度；而乙腈作為提取溶劑，對(duì)樣品基質(zhì)中的蠟類和脂肪和一些親脂性色素的提取能力較弱，能夠有效地減少提取液中雜質(zhì)。由于中藥材干粉樣品細(xì)胞多處于干癟狀態(tài)，農(nóng)藥提取效果差，在提取時(shí)先加入一定量的水，有利于提高農(nóng)藥的提取效果。因此提取時(shí)先加入10 mL水，靜置10 min后，再加入50 mL乙腈超聲提取，對(duì)三種中藥材基質(zhì)提取效果最佳。

2.2.2凈化方法的選擇嘧菌酯的凈化方法主要有固相萃取(SPE)[5 - 6]、層析柱凈化[11 - 12]以及QuEchERS法[13]。本研究用乙腈作為提取劑，對(duì)這三種凈化方法的提取效果和回收率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，三種凈化方法均滿足對(duì)嘧菌酯回收率的要求，但由于中藥材的成分較為復(fù)雜，固相萃取和QuEchERS法凈化，雜質(zhì)和目標(biāo)峰并不能達(dá)到有效分離，而層析柱凈化可以達(dá)到很好的分離效果(圖1)。故本研究選擇柱層析對(duì)這三種中藥材進(jìn)行凈化。

圖2 嘧菌酯在鐵皮石斛、浙貝母和人參中不同層析柱填料的凈化效果(添加水平為0.1 mg/kg，n=3)Fig.2 Effect of different column chromatography for azoxystrobin in dendrobium officinale,fritillaria thunbergii and panax ginseng at the 0.1 mg/kg level(n=3)

2.2.3層析柱填料選擇實(shí)驗(yàn)比較了不同層析柱填料的凈化效果，結(jié)果(圖2)顯示，活性炭層析柱凈化效果較好，但對(duì)嘧菌酯有一定的吸附性；單一弗羅里硅土和中性Al2O3作為填料時(shí)，回收率均能滿足要求，但凈化效果較差；而1 g弗羅里硅土和5 g中性Al2O3混合后作為層析柱填料時(shí)，嘧菌酯在三種中藥材基質(zhì)均能達(dá)到較好的分離和凈化效果。由于鐵皮石斛樣品中色素含量較高，容易污染檢測(cè)系統(tǒng)，在相同凈化方法的基礎(chǔ)上嘗試加入0.1 g活性炭作為層析柱填料處理，發(fā)現(xiàn)可更好地去除色素等雜質(zhì)的同時(shí)，滿足回收率的要求。

2.2.4淋洗溶劑的選擇由于鐵皮石斛、浙貝母和人參成分的復(fù)雜性，對(duì)層析柱淋洗劑的選擇較為繁瑣。為了消除基質(zhì)中共提組分對(duì)待測(cè)物的干擾，樣品提取液經(jīng)過層析柱后，分別采用一定體積的正己烷和二氯甲烷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 mL正己烷和30 mL二氯甲烷淋洗能有效地去除干擾雜質(zhì)(圖1)，且不影響回收率。去除雜質(zhì)后用30 mL、30 mL、20 mL、10 mL、10 mL二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)洗脫，分段收集，GC-ECD法檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最后20 mL洗脫液中未檢測(cè)到嘧菌酯，由此確定二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)洗脫液的用量為80 mL。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

Poole等[13]的研究表明，采用氣相色譜法測(cè)定農(nóng)藥殘留時(shí)，待測(cè)農(nóng)藥極易受到樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。本實(shí)驗(yàn)配制了一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液線性的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性斜率相比較，其增加或減少的百分比來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。如果基質(zhì)效應(yīng)的值在±10%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)可以被忽略；否則被認(rèn)為存在一定的基質(zhì)效應(yīng)[14]。從表1中可以發(fā)現(xiàn)，在3種中藥材基質(zhì)中均有明顯的信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)。故在用外標(biāo)法定量時(shí)，采用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以消除基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

分別取鐵皮石斛、浙貝母和人參空白樣品，按1.2節(jié)的方法前處理，用上清液代替乙酸乙酯作為溶劑，配制成嘧菌酯質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5 和1.0 mg/L的基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3節(jié)條件下測(cè)定，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)分別進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，在0.01～1 mg/kg范圍內(nèi)，嘧菌酯峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。分別以最小添加水平色譜圖中信噪比的3倍確定其檢出限(LOD)，以最小添加水平確定其定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。

表1 嘧菌酯在不同基質(zhì)中的線性關(guān)系、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

Matrix effect(%)=((slope matrix/slope solvent)-1)×100.

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選取不含嘧菌酯的鐵皮石斛、浙貝母和人參空白樣品，分別添加0.01、0.1和0.5 mg/kg的三個(gè)水平的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2節(jié)方法前處理和1.3節(jié)的條件測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法定量，每個(gè)水平批內(nèi)重復(fù)5次，批間重復(fù)3次，計(jì)算方法的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在0.01、0.1和0.5 mg/kg的添加水平下，嘧菌酯在3種中藥材基質(zhì)中平均回收率為85.0%～94.9%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～5.2%(n=5)，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.0%～6.7%(n=15)，結(jié)果見表2，均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求[15]。

表2 嘧菌酯在3種不同基質(zhì)中的平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究建立了鐵皮石斛、浙貝母和人參中同時(shí)適用的嘧菌酯的殘留分析方法。該方法嘧菌酯和雜質(zhì)峰均能夠完全分離，所用裝置簡(jiǎn)單，易于操作，靈敏度高，重現(xiàn)性好，且準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)。為鐵皮石斛、浙貝母和人參三種重要中藥材中嘧菌酯殘留的監(jiān)控提供了有效的檢測(cè)方法，從而有效的從源頭控制其農(nóng)藥殘留問題,對(duì)中藥材的食用安全以及出口貿(mào)易有重要意義,也為其它中藥材中嘧菌酯的殘留分析提供一定的參考。