曹麗偉*, 石依卉, 魏 甜, 譚小芳, 孟建新

(暨南大學化學與材料學院化學系，廣東廣州 510632)

卡托普利(Captopril，CAP)，其化學名為1-[(2s)-2-甲基-3-巰基-1-氧化丙基]-L-脯氨酸，它是一種常用的普利類降血壓藥，不僅適用于治療各種類型的高血壓，也可用于治療某些類型的充血性心力衰竭[1]。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)是天然L-半胱氨酸與還原型谷胱甘肽的前體，可治療心臟病、帕金森病、癌癥、艾滋病等疾病[2-3]。在臨床醫(yī)學中，有不少患者可能需要同時服用這兩種藥物。因此建立高效、靈敏的分析檢測卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的方法具有重要的意義。

目前，已報道的測定這類物質(zhì)的方法有毛細管電泳法(CE)[4]、氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6 - 7]、分光光度法[8]等。與其他方法相比，毛細管電泳法具有分離效率高、分析時間短、樣品需要量少等優(yōu)點。由于卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸均含有巰基(-SH)活性基團，所以可以引入巰基熒光探針對其進行衍生，生成強熒光產(chǎn)物，以達到高靈敏檢測的目的。目前，已用于衍生卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的熒光標記試劑有N-(4-苯甲酰苯基)馬來酰亞胺(NBM)[9]、對溴基溴化苯乙酮(p-BPB)[10]、1-苯基-2-氯溴化吡啶(BCPB)[11]、3-溴甲基異丙基安替比林(BMP)[12]和2-氯-1-甲基喹啉四氟硼酸鹽(CMQT)[13]等。上述試劑的檢測波長大多位于紫外光區(qū)，在分析生物樣品時容易受到干擾。1,3,5,7-四甲基-8-溴甲基-二氟二硼-二吡咯甲川(TMMB-Br)是一種以溴甲基為反應(yīng)基團，以氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(BODIPY)為熒光團的熒光染料，熒光吸收波長和發(fā)射波長分別為505 nm和525 nm，其衍生物具有較高的吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，光譜性質(zhì)穩(wěn)定，基本不受溶劑極性和溶液pH值的影響，且熒光光譜峰較窄。Guo等人[14]曾將該熒光染料應(yīng)用于高效液相色譜-熒光檢測法測定谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和高半胱氨酸(Hcy)。

本研究采用TMMB-Br作為N-乙酰-L-半胱氨酸和卡托普利的熒光衍生試劑，建立了一種操作簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高的毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法測定人類血清和尿液樣品中N-乙酰-L-半胱氨酸和卡托普利兩種藥物的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及電泳條件

CE-LIF檢測儀由本實驗室自組裝，包括高壓電源(0～30 kV可調(diào)；天津市東文高壓電源廠)，激光誘導熒光檢測器(10 mW，激發(fā)波長為473 nm，檢測波長520 nm；中國科學院大連物理研究所)，N2000色譜工作站(浙江大學智達信息工程有限公司)，未涂層石英毛細管(內(nèi)徑為75 μm，總長度為52 cm，有效長度為42 cm；河北永年銳灃色譜器件有限公司)。

毛細管依次用水，1.0 mol/L NaOH溶液，水，1.0 mol/L HCl，水，0.1 mol/L NaOH溶液，水以及0.1 mol/L HCl活化30 min。每天開始工作前，毛細管分別用水，0.1 mol/L NaOH溶液，水，電泳緩沖溶液沖洗5 min。進樣方式為虹吸進樣，進樣端與流出端高度差為5 cm，進樣時間15 s，溫度為室溫。

1.2 試劑及標準溶液

TMMB-Br購于美國Thermo Fisher Scientific公司，溶于無水乙腈中，配制成5.0×10-3mol/L的溶液，于-20 ℃冰箱中保存。N-乙酰-L-半胱氨酸購于上海伯奧生物科技公司，溶于蒸餾水中，配制成1.0×10-3mol/L 的標準溶液?？ㄍ衅绽徲谔旖蛳６魉忌萍加邢薰?，溶于蒸餾水中，配制成1.0×10-3mol/L的標準溶液。標準溶液均保存于-20 ℃冰箱中。其余試劑均購自廣州化學試劑廠。無水乙腈、無水甲醇經(jīng)分子篩干燥處理后使用。硼酸鹽、磷酸鹽緩沖溶液用NaOH溶液或HCl調(diào)至所需pH。實驗中所有試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 衍生方法

依次向1.5 mL的PTFE管中加入一定量的卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的混合標準溶液，50 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液，2.5×10-3mol/L TMMB-Br溶液，1 μL無水甲醇，用蒸餾水稀釋至刻度，充分混合均勻后，在一定溫度水浴中衍生。待反應(yīng)完成后加入一定量的1.0×10-6mol/L熒光素，用0.45 μm濾膜過濾后，進行毛細管電泳分析。

1.4 樣品前處理

尿液取自志愿者。取一定量尿液，在8 000×g下離心10 min以除去蛋白，上清液用0.45 μm的濾膜過濾，衍生后進行毛細管電泳分析。

血液取自志愿者。新鮮血液保存在含EDTA的抗凝固真空抽血管中。取一定量血液，在8 000×g下離心15 min以除去血細胞。取1 mL上述上清液于5 mL離心管中，加入3 mL甲醇，在8 500×g下離心10 min以除去蛋白，取其上清液在50 ℃水浴中用氮氣吹至一定體積。所得血清用0.45 μm濾膜過濾，衍生后進行毛細管電泳分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標的選擇

實驗首先考慮選擇熒光素作為內(nèi)標物來檢測巰基化合物。研究結(jié)果表明，熒光素峰與目標分析物的衍生峰在優(yōu)化的電泳條件下完全分離，其峰形較好，且出峰時間與分析物衍生峰的出峰時間接近。因此選擇熒光素作為內(nèi)標物。通過比較目標分析物衍生峰與熒光素峰的峰面積大小來優(yōu)化熒光素的濃度，最后確定加入1.0×10-6mol/L的熒光素20 μL。

2.2 電泳分離條件優(yōu)化

2.2.1背景電解質(zhì)組成和濃度對分離的影響在相同的pH值下，嘗試了毛細管電泳中常用的背景電解質(zhì)磷酸鹽、硼酸和硼砂鹽對分離的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當背景電解質(zhì)為磷酸鹽和硼砂時，衍生峰的分離難以達到較好的效果；當背景電解質(zhì)為硼酸時，衍生峰的峰形較好，且達到了基線分離，故選擇硼酸緩沖溶液為背景電解質(zhì)。進而考察了不同硼酸溶液濃度(15～35 mmol/L)對分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，硼酸溶液濃度對峰形和分離效果影響不大，但隨著硼酸溶液濃度的增加，出峰時間延長。最終選擇硼酸溶液濃度為25 mmol/L。

2.2.2背景電解質(zhì)pH值對分離的影響保持硼酸緩沖溶液濃度為25 mmol/L，研究了不同pH值(9.0，9.3，9.5，9.7，10.0)的硼酸電泳緩沖溶液對分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，衍生物峰的分離效果、出峰時間及峰形受硼酸溶液的pH值影響較小。最終選定緩沖溶液的pH值為9.5。

2.2.3分離電壓對分離的影響在毛細管電泳中，分離電壓也是控制電滲流的主要因素之一。實驗考察了不同電壓值(10.0～12.0 kV)對分離的影響。結(jié)果表明，隨著分離電壓增大，分析物衍生峰出峰時間縮短，分離效率提高，但毛細管中焦耳熱會增大，基線穩(wěn)定性和靈敏度會降低，因此選定分離電壓為11.0 kV，此時電流為0.01 mA。

2.3 衍生條件優(yōu)化

圖1 緩沖溶液pH對峰面積的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the peak area Thiol compounds concentration:6.0×10-7 mol/L;TMMB-Br:4.25×10-6 mol/L;Running buffer:25 mmol/L boric acid(pH=9.5);Separation voltage:11.0 kV;Capillary temperature:room temperature;Injection time:15 s.() CAP,() NAC.

圖2 標準溶液衍生物的毛細管電泳Fig.2 Typical electropherogram of TMMB-Br derivatives Running buffer:25 mmol/L boric acid(pH=9.5);Separation voltage:11.0 kV;Capillary temperature:room temperature.Injection time:15 s;Thiol compounds concentration:6.0×10-7mmol/L;I S concentration:2.0×10-8 mol/L;TMMB-Br:4.25×10-6 mol/L.Peaks:1,CAP;2,NAC;3,Fluorescein.

2.3.1衍生緩沖溶液pH值的影響實驗考察了不同pH值(7.5～9.5)的50 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液對衍生物峰面積的影響(圖1)。結(jié)果表明，隨著緩沖溶液pH值的增加，衍生物的峰面積逐漸增加。當pH值大于8.5時，衍生物峰面積有所下降。故最終選用pH為8.5，濃度為50 mmol/L NaH2PO4溶液為衍生緩沖溶液。

2.3.2TMMB-Br濃度的影響探討了TMMB-Br濃度在2.0×10-6～5.0×10-6mol/L的范圍內(nèi)對衍生效率的影響。結(jié)果顯示，當衍生試劑濃度為4.25×10-6mol/L時，衍生物峰面積達到最大且穩(wěn)定。因此，實驗選擇4.25×10-6mol/L為TMMB-Br的濃度。

2.3.3衍生溫度和時間的影響考察了反應(yīng)溫度在30～55 ℃范圍內(nèi)對分析物衍生峰峰面積的影響，研究結(jié)果表明，40 ℃衍生效率最大，選擇40 ℃為最佳反應(yīng)溫度。在40 ℃下，考察不同反應(yīng)時間對卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸衍生物的峰面積的影響。結(jié)果表明，衍生物峰面積在10 min時都達到最大且穩(wěn)定。因此選擇衍生反應(yīng)時間為10 min。

2.4 線性回歸分析和檢出限

在所選定的最佳分離和衍生條件下，卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的衍生混合物可在14 min內(nèi)達到基線分離，標準溶液毛細管電泳圖如圖2所示。對樣品進行連續(xù)5次電泳分析后，得到兩種衍生物的保留時間和衍生峰面積的相對標準偏差(RSD)。以衍生物與內(nèi)標峰面積的比值(Y)為縱坐標，以分析物的濃度(X，nmol/L)為橫坐標作圖，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。檢出限以峰高與噪音比值(S/N=3)計算。結(jié)果如表1所示。

表1 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

Note:PA,peak area;MT,migration time.

2.5 分析應(yīng)用

將該方法應(yīng)用于人體尿液與血清樣品中卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的測定。如圖3所示，樣品基質(zhì)對分析物的測定沒有干擾，樣品加標回收率在97.0%～105.7% 之間。分析物衍生峰的峰面積和遷移時間的RSD的范圍分別為0.15%～3.79% 和0.15%～2.23%。

圖3 (A)空白血清樣品譜圖；(B)添加濃度為6.0×10-8 mol/L標準溶液的血清樣品譜圖；(C)添加濃度為2.0×10-7 mol/L標準溶液的血清樣品譜圖；(D)空白尿液樣品譜圖；(E)添加濃度為6.0×10-8 mol/L標準溶液的尿液樣品譜圖；(F)添加濃度為2.0×10-7 mol/L標準溶液的尿液樣品譜圖Fig.3 Electropherograms obtained from human serum and urine sample.(A) blank serum sample;(B) serum with standard mixture(6.0×10-8 mol/L);(C) serum with standard mixture(2.0×10-7 mol/L);(D) blank urine sample;(E) urine with standard mixture(6.0×10-8 mol/L);(F) urine with standard mixture(2.0×10-7 mol/L) Running buffer:25 mmol/L boric acid(pH=9.5);Separation voltage:11.0 kV;Capillary temperature:room temperature;Injection time:15 s.Peaks:1,CAP;2,NAC;3,Fluorescein.

2.6 其他方法比較

將本文所建立的CE-LIF檢測N-乙酰-L-半胱氨酸和卡托普利的方法中的衍生條件、檢測波長和檢出限與已報道的其它方法進行了比較，結(jié)果見表2。由表所示，TMMB-Br 10 min 內(nèi)即可完成衍生反應(yīng)，方法簡單迅速，靈敏度高。與其它方法相比，具有一定的優(yōu)勢。

表2 與其他方法比較

3 結(jié)論

本文建立了以TMMB-Br為柱前衍生試劑，毛細管電泳分離-激光誘導熒光檢測卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸兩種藥物的方法。在優(yōu)化條件下，卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸的檢出限(S/N=3)分別為0.65 nmol/L和0.76 nmol/L。該方法具有操作簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點，成功應(yīng)用于人體血清和尿液中的卡托普利和N-乙酰-L-半胱氨酸藥物的測定，加標回收率在97.0%～105.7% 之間。