楊紅艷， 于永麗*， 王月紅， 王 猛

(1.東北大學(xué)理學(xué)院，遼寧沈陽 110819；2.中國刑警學(xué)院痕跡檢驗(yàn)技術(shù)系，遼寧沈陽 110035)

稀土離子因其特殊的4f電子組態(tài)能級及躍遷模式而呈現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)性能，如Stokes位移大、發(fā)射譜帶窄、發(fā)光壽命長、發(fā)光穩(wěn)定性好等[1]。依據(jù)發(fā)光機(jī)理，稀土發(fā)光材料可分為上轉(zhuǎn)換發(fā)光和下轉(zhuǎn)換發(fā)光。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為熒光探針，通常采用近紅外光激發(fā)，由于近紅外光對生物組織具有較強(qiáng)的穿透能力，因此，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在細(xì)胞以及生物組織成像的研究中具有特別的優(yōu)勢[2 - 3]。與上轉(zhuǎn)換材料相比，下轉(zhuǎn)換材料的優(yōu)點(diǎn)是合成方法簡單，易于實(shí)現(xiàn)粒子的功能化修飾，產(chǎn)物的發(fā)光強(qiáng)度大[4]。目前，下轉(zhuǎn)換納米粒子的應(yīng)用主要集中在靶向給藥[5]、發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移[6]和免疫分析[7 - 8]等方面。作為稀土發(fā)光材料的基質(zhì)材料，磷酸鹽具有穩(wěn)定性好、不易分解、生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)，而以LaPO4為基質(zhì)，Ce、Tb共摻的納米材料發(fā)光強(qiáng)度大，光學(xué)性能優(yōu)異[9]。

細(xì)胞色素C(Cyt C)是一種以鐵卟啉為輔基的可溶性色素蛋白，普遍存在于原核生物及真核生物的需氧組織中，在生物氧化過程中是一種非常重要的電子傳遞體，具有激活細(xì)胞呼吸能力的作用，臨床上將其作為組織缺氧治療的急救用藥和輔助用藥。有研究表明，Cyt C與細(xì)胞凋亡有關(guān)，從線粒體中泄露出的Cyt C有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[10]。2014年以來，已報(bào)道測定Cyt C的方法主要有電化學(xué)法[11]、表面等離子共振法[12]、熒光法[13 - 14]和共振瑞利散射法[15]。這些測定方法各有特點(diǎn)，如較高的靈敏度和較寬的線性范圍，但也存在電極和熒光探針的制備比較復(fù)雜耗時(shí)[11 - 14]的缺點(diǎn)。

本文采用水熱法制備了膦酰基羧酸共聚物(POCA)修飾的LaPO4∶Ce,Tb 納米粒子(LaPO4∶Ce,Tb NPs)，該合成方法反應(yīng)條件溫和、簡單快速，制備的納米粒子發(fā)光強(qiáng)度大、水溶性好，無需后續(xù)功能化修飾。在適當(dāng)?shù)膒H值下，LaPO4∶Ce,Tb NPs和納米金(Au NPs)可通過靜電作用與Cyt C結(jié)合，據(jù)此構(gòu)建了以Cyt C為橋，LaPO4∶Ce,Tb NPs為能量供體，Au NPs為能量受體的發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(LRET)體系，建立了一種測定 Cyt C的新方法。目前，尚未見有以稀土下轉(zhuǎn)換納米粒子為發(fā)光探針測定Cyt C的報(bào)道，本文的研究內(nèi)容拓展了稀土探針在生物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

傅立葉紅外光譜采用美國Perkin-Elmer公司Spectrum one傅立葉紅外光譜儀(KBr壓片，掃描范圍為400～4 000 cm-1)；X-射線衍射(XRD)表征采用荷蘭PANalytical公司Rigaku/Dmax-r B X-射線衍射儀(Cu靶Kα輻射，掃描范圍為10°～60°)；透射電鏡(TEM)形貌分析采用美國FEI公司Tecnai G20透射電子顯微鏡；發(fā)光光譜采用美國瓦里安公司Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)掃描納米粒子溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜(狹縫寬度為10.0 nm，電壓550 V，掃描速度為240 nm/min)。

La2O3、Tb2O3均為高純試劑(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司)；Ce(NO3)3·6H2O、HAuCl4·3H2O均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；膦?；人峁簿畚?POCA)(山東泰和水處理有限公司，固含量31.49%)；馬心細(xì)胞色素C(含量≥95.0%,Sigma公司)。實(shí)驗(yàn)用水為三次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1LaPO4∶Ce,TbNPs和AuNPs的制備分別移取2.5、1.5和1.0 mL濃度為 0.1 mol·L-1的La(NO3)3、Ce(NO3)3和Tb(NO3)3溶液于錐形瓶中，然后滴加26 mL 1∶100(POCA和水的體積比)的POCA溶液和4.0 mL濃度為0.1 mol·L-1的Na3PO4溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)上述溶液pH值為9.0，然后將其密封于聚四氟乙烯襯底的高壓反應(yīng)釜中，在160 ℃恒溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，向產(chǎn)物溶液中加入兩倍體積的甲醇，離心分離得到納米粒子。之后用pH值為7.5的NaOH溶液分散，得到濃度為1.0×10-2mol·L-1LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液，待用。參照文獻(xiàn)方法[16]制備Au NPs：首先在1.0 mL 1%HAuCl4溶液中加入80 mL水，磁力攪拌下加熱至60 ℃，形成A液；再在2.0 mL 1%的檸檬酸鈉溶液中加入20 mL水，同樣加熱至60 ℃，形成B液。10 min后將B液迅速倒入A液中，在磁力攪拌下反應(yīng)30 min 后冷卻至室溫，得到濃度為2.5×10-4mol·L-1的Au NPs溶液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別向一系列離心管中加入適量pH為7.0的濃度為0.15 mol·L-1硼酸-硼砂緩沖溶液(BBS)和300 μL 濃度為2.5×10-4mol·L-1的Au NPs溶液，然后依次加入不同體積(10.0～630 μL)濃度為100 μg·mL-1的Cyt C標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分搖勻后加入200 μL濃度為1.0×10-2mol·L-1的LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液，最后用BBS定容至3.00 mL。將該溶液于35 ℃恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)40 min，用熒光分光光度計(jì)測定其在545 nm處的發(fā)光強(qiáng)度I，同時(shí)測定未加Cyt C時(shí)溶液的發(fā)光強(qiáng)度I0，以發(fā)光猝滅程度△I(△I=I0-I)對Cyt C濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 LaPO4∶Ce,Tb發(fā)光納米粒子的表征

圖1 LaPO4∶Ce,Tb NPs的激發(fā)(a)和發(fā)射(b)光譜Fig.1 Excitation(a)and emission (b) spectra of LaPO4∶Ce,Tb NPs c=1.0×10-2 mol·L-1.

圖1為所制備的LaPO4∶Ce,Tb NPs的激發(fā)(a)和發(fā)射光譜(b)。從圖中可看出，納米粒子在279 nm波長處有較寬的激發(fā)峰，這是Ce(Ⅲ)電子從4f向5d能級躍遷產(chǎn)生；以279 nm光激發(fā)時(shí)，納米粒子分別在488、545、585和619 nm處有四個(gè)較強(qiáng)的發(fā)射峰，為Tb(Ⅲ)的特征發(fā)射，分別歸屬于Tb(Ⅲ)的7F6、7F5、7F4、7F3到5D4電子組態(tài)的躍遷[9]。由于LaPO4∶Ce,Tb NPs最大發(fā)射峰在545 nm處，所以，在紫外光激發(fā)下，LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液呈現(xiàn)明亮的綠色。

圖2 LaPO4∶Ce,Tb NPs的X-射線衍射(XRD)圖(A)、透射電鏡(TEM)圖(B)和紅外(IR)光譜圖(C)Fig.2 XRD pattern(A), TEM image(B) and IR spectrum(C) of LaPO4∶Ce,Tb NPs

本實(shí)驗(yàn)制備了POCA修飾的LaPO4∶Ce,Tb NPs，由于POCA分子中有親水性的羧基，所以納米粒子的水溶性良好，且無需進(jìn)一步修飾即可通過靜電或共價(jià)作用與生物分子連接，實(shí)現(xiàn)分析應(yīng)用。

2.2 發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建及機(jī)理探討

圖3 LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1)發(fā)射光譜(a)和Au NPs(c=2.5×10-4 mol·L-1)吸收光譜(b)Fig.3 Emission spectrum of LaPO4∶Ce,Tb NPs(a)(c=7×10-4 mol·L-1)and absorption spectrum of Au NPs(b)(c=2.5×10-4 mol·L-1)

發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(LRET)體系的建立需要滿足三個(gè)條件[18]：(1)能量供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜必須有足夠的重疊；(2)能量供體和受體的發(fā)射光譜有足夠的分離，從而可以同時(shí)分別檢測供受體的發(fā)射光譜；(3)能量供體和受體之間的距離必須足夠接近。圖3是LaPO4∶Ce,Tb NPs的發(fā)射光譜(a)與Au NPs的吸收光譜(b)。可看出，LaPO4∶Ce,Tb NPs的發(fā)射光譜和Au NPs的吸收光譜有很好的重疊，這滿足了LRET的第一個(gè)條件。其次，Au屬于猝滅性能量受體，在獲得能量后不產(chǎn)生光發(fā)射，因此不會干擾供體發(fā)光強(qiáng)度的測定，這滿足了第二個(gè)條件。最后，本實(shí)驗(yàn)制備的LaPO4∶Ce,Tb NPs表面修飾了POCA，由于POCA分子中的羧基在中性或堿性溶液中失去質(zhì)子，所以粒子帶有負(fù)電荷；Au NPs是通過檸檬酸鈉還原法制備，其表面也帶有負(fù)電荷[16]。LaPO4∶Ce,Tb NPs和Au NPs由于靜電排斥作用，二者不能建立共振能量轉(zhuǎn)移體系。當(dāng)向上述體系中加入Cyt C時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)條件下(pH=7.0)，Cyt C帶正電(等電點(diǎn)為10.8)，通過靜電吸引作用，Cyt C可以和LaPO4∶Ce,Tb NPs以及Au NPs結(jié)合，形成以Cyt C為橋的LaPO4∶Ce,Tb-Cyt C-Au復(fù)合結(jié)構(gòu)。此時(shí)，LaPO4∶Ce,Tb NPs和Au NPs的距離被縮短，滿足了發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移第三個(gè)條件，從而發(fā)生從LaPO4∶Ce,Tb NPs到Au NPs的能量傳遞，建立發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系。圖4為該共振能量轉(zhuǎn)移體系的示意圖。

圖4 LaPO4∶Ce,Tb-Cyt C-Au發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移示意圖Fig.4 Schematic illustration of the LRET process from LaPO4∶Ce,Tb NPs to Au NPs

圖5 不同濃度的 Cyt C對LaPO4∶Ce,Tb-Au體系發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of different concentrations of Cyt C on the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb-Au system 1-7：0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0 μg·mL-1.

向LaPO4∶Ce,Tb-Au體系中加入不同濃度Cyt C，測定溶液體系的發(fā)光譜圖，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，體系發(fā)光強(qiáng)度隨Cyt C濃度的增大而降低，這是因?yàn)椋珻yt C的濃度越大，供體和受體結(jié)合的數(shù)目越多，LaPO4∶Ce,Tb NPs發(fā)光被猝滅的程度越嚴(yán)重。這為建立Cyt C的定量分析方法奠定了基礎(chǔ)。

2.3 基于發(fā)光共振能量體系測定Cyt C

固定LaPO4∶Ce,Tb NPs的濃度為7.0×10-4mol·L-1，對測定Cyt C的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，Au NPs的加入量、反應(yīng)溶液pH值和BBS濃度對納米粒子發(fā)光猝滅的影響見圖6。圖6的縱坐標(biāo)為納米粒子發(fā)光被猝滅的百分率。由圖6(A)可見，隨著Au NPs加入量的增加，納米粒子發(fā)光被猝滅的百分率逐漸增大，當(dāng)Au NPs加入量大于300 μL時(shí)，發(fā)光被猝滅的百分率的增大幅度趨于平緩，選擇Au NPs加入量為300 μL。由于本實(shí)驗(yàn)中Cyt C和LaPO4∶Ce,Tb NPs以及Au NPs是通過靜電結(jié)合，為保證Cyt C帶正電荷，必須控制溶液pH值在Cyt C的等電點(diǎn)(10.8)以下。同時(shí)為保證稀土粒子和納米金帶負(fù)電荷，pH值較大為好，因此實(shí)驗(yàn)選擇考察的pH范圍為6.0～10.0。由圖6(B)可見，在pH為6.0～7.0時(shí)，猝滅最大且數(shù)值穩(wěn)定，所以選擇pH值為7.0。在確定溶液pH值為7.0的基礎(chǔ)上，為保證反應(yīng)溶液pH值的穩(wěn)定，需適量加入緩沖溶液，常見的緩沖溶液，如磷酸氫二鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，加入后溶液中粒子發(fā)生凝聚，而BBS加入后體系穩(wěn)定，因此選擇BBS為該體系的緩沖溶液?？疾炝瞬煌瑵舛菳BS對納米粒子發(fā)光猝滅的百分率的影響，由圖6(C)可知，當(dāng)BBS的濃度為0.15 mol·L-1時(shí)猝滅百分率最大。

圖6 Au NPs加入量(A)、pH值(B)和BBS濃度(C)對LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1)發(fā)光猝滅的影響Fig.6 Effects of the volumes of Au NPs(A),pH values (B)and the concentrations of BBS(B) on the luminescent quenching of LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1) I0:the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb NPs before adding Cyt C;I1:the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb NPs after adding Cyt C(c=2.0 μg·mL-1).

2.4 方法的選擇性

為了考察該分析方法的選擇性，實(shí)驗(yàn)考察了一些常見離子對LaPO4∶Ce,Tb-Au體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。測定結(jié)果表明，在Cyt C的濃度為6.67 μg·mL-1時(shí)，當(dāng)體系中K+、Na+、Mg2+、Al3+、Cl-的濃度為400 μg·mL-1時(shí)，Ba2+、Ca2+的濃度為100 μg·mL-1時(shí)，Zn2+、Mn2+、Cd2+的濃度為30 μg·mL-1時(shí)，體系相對發(fā)光強(qiáng)度變化程度均小于5%，即上述離子對體系無干擾。當(dāng)Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+的濃度為0.5 μg·mL-1時(shí)，體系相對發(fā)光強(qiáng)度變化程度大于6%，說明此時(shí)這四種離子對測定有干擾。

2.5 方法的分析性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)Cyt C的濃度在0.333～21.0 μg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，LaPO4∶Ce,Tb-Au體系發(fā)光猝滅強(qiáng)度△I與Cyt C的濃度(c)有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:△I=19.1c+28.0(c：μg·mL-1)，相關(guān)系數(shù)R=0.9962，檢出限(S/N=3)為0.2 μg·mL-1。對濃度為10.0 μg·mL-1的Cyt C溶液平行測定11次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.46%。

2.6 樣品分析

采用本文建立的分析方法測定某制藥公司生產(chǎn)的細(xì)胞色素C注射液中的Cyt C，同時(shí)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該注射液中Cyt C含量為10.8 μg·mL-1，加標(biāo)回收率為100%～101%，表明本測試方法準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)建立的Cyt C的分析方法簡單快速，選擇性較好，檢測靈敏度和文獻(xiàn)報(bào)道[13 - 14]相當(dāng)，可用于實(shí)際樣品的測定。

表1 細(xì)胞色素C注射液中Cyt C含量的測定及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文采用水熱法制備了光學(xué)性能優(yōu)異的LaPO4∶Ce,Tb NPs，該粒子具有良好的水溶性和生物相容性，采用XRD、TEM和FTIR光譜對合成粒子進(jìn)行了表征。以LaPO4∶Ce,Tb NPs為能量供體，Au NPs為能量受體，通過Cyt C橋的作用，基于靜電引力構(gòu)建了LRET體系。基于以上LRET體系，建立了測定Cyt C 的分析方法，該方法的線性范圍較寬，靈敏度較高，選擇性較好。一直以來，稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子的制備及其應(yīng)用都是研究熱點(diǎn)，而關(guān)于稀土下轉(zhuǎn)換納米粒子的研究較少。鑒于下轉(zhuǎn)換納米粒子的制備方法簡單易行、光學(xué)性能優(yōu)異，相信在以后的科學(xué)研究中會受到更多的關(guān)注。