張 艷 盛安琪 劉文濤 胡 亮 陶學有 張廣欽

原花青素抑制小膠質細胞活化緩解阿片藥誘導的痛覺過敏

張 艷 盛安琪 劉文濤 胡 亮 陶學有 張廣欽

目的 探討原花青素(PC)對小膠質細胞活化和阿片藥誘導的痛覺過敏(OIH)的影響及其分子機制。方法 采用甩尾法檢測OIH小鼠甩尾痛閾；免疫熒光法和Western blot法檢測小鼠脊髓水平小膠質細胞標記分子(Iba1)表達水平。結果 將小鼠分為嗎啡組、嗎啡加PC給藥組(20、 40、 80 mg/kg)和對照組(給予等體積生理鹽水)。實驗結果表明, 小鼠OIH造模后, 基礎閾值由(9.35±0.48)s降至(5.47±0.39)s, 而對照組沒有明顯改變, 表示模型建立成功。提前15 min PC灌胃給藥能夠改善嗎啡引起的OIH。40 mg/kg給藥組灌胃給藥2 d后小鼠熱痛閾值與模型組相比, 差異具有統計學意義(P<0.05), 第2~5天改善效率分別為22.13 %、46.05%、33.50%、28.19%、44.70%。20、80 mg/kg給藥組也有一定程度改善作用,但效果不如40 mg/kg給藥組。采用免疫熒光技術和Western blot檢測小鼠脊髓中小膠質細胞標記物Iba1的活化情況。免疫熒光結果表明, 與對照組相比, 模型組小鼠脊髓中Iba1明顯激活, 而PC(40 mg/kg)可以顯著抑制OIH小鼠脊髓中的Iba1的表達水平。Western blot法檢測Iba1得到結果相似。結論 PC可以通過抑制小膠質細胞活化緩解OIH。

原花青素；阿片藥誘導的痛覺過敏；神經炎癥；小膠質細胞

嗎啡是臨床上常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物, 用于癌痛等頑固性疼痛的治療。但是, 短期大劑量應用或者長期應用會導致機體對傷害性刺激的敏感性增高, 這種由阿片類藥物導致的痛覺敏感性增加稱為阿片藥誘導的痛覺過敏(opioid-induced hyperalgesia, OIH), 嚴重限制了阿片類藥物的使用［1-3］。目前,關于OIH的產生機制未完全闡明, 主要集中在中樞谷氨酸能系統活性增強、脊髓下行易化作用、內源性神經肽的作用等。而近期研究逐步開始聚焦脊髓膠質細胞, 尤其是小膠質細胞。小膠質細胞激活介導的神經炎癥在疼痛中至關重要［4-7］。研究指出, 嗎啡激活小膠質細胞中NOD 樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體, 促使炎癥因子(如白介素-1β、腫瘤壞死因子-α等)大量釋放, 這些炎癥因子作為中樞免疫信號介導嗎啡誘導的持續(xù)性痛覺敏化作用, 從而增加對傷害性刺激的敏感性［8-12］。原花青素(procyanidins, PC)是葡萄籽、藍莓、櫻桃等植物中廣泛存在的一種生物類黃酮, 具有抗氧化、抗炎、改善肥胖等作用。近期有研究發(fā)現, PC可以通過抑制巨噬細胞活化從而改善急性痛風性關節(jié)炎［3］。但其對于OIH的作用未見報道。本文擬用不同劑量的PC, 研究其對小膠質細胞的活化和對OIH的影響并簡要探討其分子機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 PC(南京澤朗醫(yī)藥植提技術有限公司)；嗎啡(沈陽第一制藥廠)。

1.2 動物 30只健康雄性ICR小鼠, 體重18~22 g, 由江蘇省南京青龍山動物繁殖場提供, 實驗動物許可證號：SYXK(蘇 )2016-0011。

1.3 儀器 熒光顯微鏡(Zeiss AX10)；電泳儀(Bio-Rad)；化學發(fā)光儀(ChemiDoc XRS+)。

1.4 方法

1.4.1 OIH模型小鼠的制備及行為學測定 皮下注射10 mg/kg嗎啡, 連續(xù)注射5 d, 2次/d 。以造模前1 d測得的小鼠熱痛閾值作為基礎痛閾。測量3次, 間隔10 min, 取平均值。以造模后熱痛閾值較基礎痛閾下降>20%者視為OIH模型成功。具體方法如下：將小鼠尾1.5~3.0 cm浸入恒溫水浴中(47±0.5)℃, 用秒表記錄鼠尾自浸入水中到出現甩尾動作的時間, 為防止組織損傷, 若小鼠10 s未甩尾, 則記為10 s。

1.4.2 Western blot法檢測Iba1蛋白水平的表達 于第5天給藥后取小鼠脊髓L4~6節(jié)段；按一定比例加入裂解液, 處理樣品, 經聚丙烯酰胺凝膠電泳, 轉移至PDVF膜上, 10%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h, 加入一抗過夜, TBST洗后二抗孵育2 h,TBST洗后顯色。

1.4.3 免疫熒光檢測脊髓背角Iba1表達 于第5天給藥后0.5 h, 水合氯醛深麻下打開胸腔, 經左心室插管依次灌注生理鹽水30 ml、4%多聚甲醛30 ml。取小鼠脊髓腰膨大部位經4%多聚甲醛固定、40%蔗糖溶液脫水后, 進行連續(xù)恒冷冰凍切片。將切片加入一抗過夜, 磷酸緩沖液(PBS)洗后加入熒光二抗孵育2 h, PBS洗后用50%甘油封片, 在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統計學方法 采用GraphPad Prism6軟件數據處理。計量資料以均數±標準差s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 OIH小鼠熱痛閾值的變化 水浴甩尾法測定小鼠熱痛閾值。小鼠分為五組, 嗎啡組、嗎啡加PC給藥組(20、40、80 mg/kg)和對照組(給予等體積生理鹽水)。實驗結果表明,小鼠OIH造模后, 基礎閾值由(9.35±0.48)s降至(5.47±0.39)s,而對照組沒有明顯改變, 表示模型建立成功。提前15 min PC灌胃給藥能夠改善嗎啡引起的OIH。40 mg/kg給藥組灌胃給藥2 d后小鼠熱痛閾值與模型組相比, 差異具有統計學意義 (P＜0.05) , 第2~5天改善效率分別為22.13%、46.05%、33.50%、28.19%、44.70%。20、80 mg/kg給藥組也有一定程度改善作用, 但效果不如40 mg/kg給藥組。見圖1。

2.2 PC對OIH小鼠脊髓小膠質細胞活化的影響 采用免疫熒光技術和Western blot檢測小鼠脊髓中小膠質細胞標記物Iba1的活化情況。免疫熒光結果表明, 與對照組相比, 模型組小鼠脊髓中Iba1明顯激活, 而PC(40 mg/kg)可以顯著抑制OIH小鼠脊髓中的Iba1的表達水平。見圖2。Western blot法檢測Iba1也得到相似結果。見圖3。

圖1 連續(xù)PC灌胃給藥對小鼠熱痛閾值的影響

圖2 免疫熒光法檢測PC對小鼠脊髓背角Iba1的影響

圖3 Western blot法檢測PC對小鼠脊髓背角Iba1的影響

3 討論

現有的改善OIH的藥物主要有N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、環(huán)氧化酶-2抑制劑、鈣離子通道阻滯劑、α2受體阻斷劑等［13-17］。但這些都不能徹底改善OIH,并且具有一定的副作用, 給患者帶來沉重的經濟負擔和心理壓力［18］。而本實驗中使用的PC最高劑量為80 mg/kg, 等效人體劑量僅6.66 mg/kg, 抗炎效果佳, 安全性好, 無疑具有巨大的臨床應用前景。

研究發(fā)現炎癥因素在嗎啡耐受中發(fā)揮著至關重要的作用［19］。嗎啡激活神經突觸后膜受體, 同時可以結合到小膠質細胞表面toll樣受體4的MD-2亞基, 激活小膠質細胞, 進而釋放大量促炎因子, 如炎癥因子白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α［20-22］。這些炎癥因子一方面激活鄰近的膠質細胞, 誘發(fā)胞膜表面更多嘌呤能P2X4、P2X7受體、toll樣受體4等表達增加；另一方面激活鄰近的神經元上相應受體, 進一步促進NMDA受體的激活, 促進鈣離子內流, 導致神經元異常性興奮, 拮抗嗎啡的鎮(zhèn)痛作用［23］。實驗室前期工作已經發(fā)現, PC可以通過抑制小膠質細胞激活來改善嗎啡耐受［24］, 但是PC對于OIH的影響尚未報道。本實驗研究發(fā)現, PC能抑制嗎啡引起的脊髓背角小膠質細胞的活化, 顯著改善阿片藥物導致的OIH。Weng 等［25］應用半胱天冬酶抑制劑可以通過抑制小膠質細胞活化來改善嗎啡耐受以及OIH癥狀。本文研究與上述研究結果一致。此外, PC可以通過抑制p38 MAPK緩解脂多糖誘導的炎癥反應, 而p38 MAPK是主要表達在小膠質細胞中的MAPK家族成員。

綜上所述, PC可能通過抑制小膠質細胞活化, 減輕神經炎癥反應, 從而改善嗎啡導致的OIH。目前, PC主要功效是抗氧化、抗過敏等。本實驗發(fā)現PC可以抑制小鼠OIH的產生, 并對其可能的機制, 即抑制小膠質細胞活化進行了考察。研究成果為將來臨床上應用PC治療OIH提供理論依據, 并為阿片類鎮(zhèn)痛藥物的安全應用提供新的思路。

［1］ Roeckel LA, Le CG, Gavériaux-Ruff C, et al.Opioid-induced hyperalgesia: Cellular and molecular mechanisms.Neuroscience,2016(338):160-182.

［2］ Grace PM, Strand KA, Galer EL, et al.Morphine paradoxically prolongs neuropathic pain in rats by amplifying spinal NLRP3 inflammasome activation.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(24):E3441.

［3］ Liu HJ, Pan XX, Liu BQ, et al.Grape seed-derived procyanidins alleviate gout pain via NLRP3 inflammasome suppression.Journal of Neuroinflammation, 2017, 14(1):74.

［4］ Bagchi D, Bagchi M, SjS, et al.Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape seeds.Annals of the New York Academy of Sciences, 2002, 957(1):260-270.

［5］ Gu L, Kelm MA, Hammerstone JF, et al.Concentrations of proanthocyanidins in common foods and estimations of normal consumption.Journal of Nutrition, 2004, 134(3):613.

［6］ Santosbuelga C, Scalbert A.Proanthocyanidins and tannin-like compounds--nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health.Journal of the Science of Food & Agriculture,2000, 80(7):1094-1117.

［7］ 崔介君, 孫培龍, 馬新.原花青素的研究進展.食品科技,2003(2):92-95.

［8］ 凌智群, 張曉輝, 謝筆鈞,等.原花青素的藥理學研究進展.中國藥理學通報, 2002, 18(1):9-12.

［9］ 余瑩, 粟武, 魏東芝.原花青素體外清除自由基活性的研究.華東理工大學學報(自然科學版), 2002, 28(3):318-320.

［10］ 國植, 徐莉.原花青素:具有廣闊發(fā)展前景的植物藥.現代藥物與臨床, 1996(5):196-204.

［11］ 萬本屹, 李宏, 董海洲.葡萄籽原花青素提取及其應用研究進展.糧食與油脂, 2002(2):43-45.

［12］ 呂麗爽, 曹棟.脫脂葡萄籽中低聚原花青素的提取.食品與生物技術學報, 2001, 20(2):208-210.

［13］ 趙超英, 姚小曼.葡萄籽提取物原花青素的營養(yǎng)保健功能(綜述).中國食品衛(wèi)生雜志, 2000, 12(6):38-41.

［14］ 李春陽, 許時嬰, 王璋.DPPH法測定葡萄籽原花青素清除自由基的能力.食品與生物技術學報, 2006, 25(2):102-106.

［15］ 萬本屹, 董海洲, 劉傳富.原花青素及其應用.中國食物與營養(yǎng), 2001(6):15-16.

［16］ 趙艷, 吳坤.原花青素生物學作用研究進展.中國公共衛(wèi)生,2006, 22(1):110-111.

［17］ 汪靜.星形膠質細胞在福爾馬林誘導的大鼠炎性持續(xù)性痛覺過敏中的作用.蘭州大學, 2012.

［18］ 劉獻文, 劉忠, 張宗旺,等.小膠質細胞參與尼古丁戒斷切口痛大鼠術后痛覺過敏的研究.國際麻醉學與復蘇雜志, 2014,35(4):331-335.

［19］ 姜艷華, 王秋石, 馬虹.己酮可可堿通過抑制小膠質細胞激活減輕大鼠痛覺超敏和痛覺過敏.中國新藥雜志, 2008, 17(20):1770-1773.

［20］ 成浩, 楊建平, 張艷兵,等.鞘內注射米諾環(huán)素抑制脊髓小膠質細胞激活減輕炎性痛覺過敏.蘇州大學學報(醫(yī)學版), 2007,27(1):14-16.

［21］ 于虹.鎮(zhèn)靜藥咪達唑侖對鼠膠質細胞激活及阿片耐受的影響和機制研究.華北理工大學, 2016.

［22］ Dixon RA, Xie DY, Sharma SB.Proanthocyanidins: A Final Frontier in Flavonoid Research? New Phytologist, 2005, 165(1):9-28.

［23］ Parsadaniantz SM, Rivat C, Rostène W, et al.Opioid and chemokine receptor crosstalk: a promising target for pain therapy? Nature Reviews Neuroscience, 2015, 16(2):69.

［24］ Cai Y, Pan YB, Jiang L, et al.Procyanidins alleviates morphine tolerance by inhibiting activation of NLRP3 inflammasome in microglia.Journal of Neuroinflammation, 2016, 13(1):53.

［25］ Weng Z, Lin Y, Zhang J, et al.Caspase inhibitors may attenuate opioid-induced hyperalgesia and tolerance via inhibiting microglial activation and neuroinflammation.Iranian Journal of Medical Hypotheses & Ideas, 2013, 7(2):31-34.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.19.110

2017-08-17］

江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)(項目編號：BK20161033)

211198 中國藥科大學/臨床藥學教研室(張艷 盛安琪 張廣欽)；南京醫(yī)科大學/江蘇省神經退行性疾病重點實驗室(胡亮 陶學有)

張廣欽