周延清+楊珂+張喻+張丹丹+李夢辰+余萌

摘要：用RT-PCR技術(shù)從地黃[Rehmannia glutinosa （Gaertn.） Libosch.]幼葉中克隆地黃基因RghBNG，使用Pst I和Hind Ш分別酶切地黃基因RghBNG和植物表達載體pCAMBIA302-GFP，經(jīng)過重組，構(gòu)建其過表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，獲得其工程菌；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將該基因轉(zhuǎn)入地黃幼葉細胞，再生轉(zhuǎn)化地黃植株。經(jīng)過潮霉素抗性篩選、PCR和qRT-PCR檢測，獲得過表達基因RghBNG地黃植株。這些結(jié)果為進一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地黃[Rehmannia glutinosa （Gaertn.） Libosch.]；RghBNG；過表達載體；qRT-PCR；農(nóng)桿菌介導(dǎo)

中圖分類號：R282；Q786 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3342-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.039

The Transformation of Rehmannia glutinosa RghBNG Gene into Rehmannia

glutinosa （Gaertn.） Libosch. for Overexpression

ZHOU Yan-qing， YANG Ke， ZHANG Yu， ZHANG Dan-dan， LI Meng-chen， YU Meng

（College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The RghBNG gene was cloned from Rehmannia glutinosa（Gaertn.） Libosch. leaves by RT-PCR. Pst I and Hind III as upstream and downstream enzyme，respectively，were used to digest RghBNG and the plant expression vector pCAMBIA-l302 in order to construct plant overexpression vector pCAMBIAl302-RghBNG-GFP. The overexpression vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 so that its engineered bacteria were obtained. RghBNG was transformed into Rehmannia glutinosa（Gaertn.） Libosch. leaf cells using Agrobacterium-mediated transformation，and hygromycin-resistant transgenic Rehmannia glutinosa（Gaertn.） Libosch. plantlets were obtained via tissue culture，which were confirmed by PCR and qRT-PCR analyses. These results will build up the foundation for further verification of RghBNG functions and its application in Rehmannia glutinosa （Gaertn.） Libosch. genetic improvement.

Key words： Rehmannia glutinosa（Gaertn.） Libosch.；RghBNG；overexpression vector；RT-qPCR；Agrobacterium-mediated transformation

地黃[Rehmannia glutinosa （Gaertn.） Libosch.] 為玄參科（ScrophuLariaceae）地黃屬植物，主要栽培品種有懷地黃1號（金壯元）、懷地黃2號（北京1號）、懷地黃3號（溫85-5）和金九等，主要分布在中國的河南、山東、陜西和山西等地，但河南焦作的“懷慶府”的懷地黃最為著名[1]。地黃多以塊根入藥，以炮制方法不同，可分為鮮地黃、生地黃和熟地黃3種形式。地黃主要化學(xué)成分為糖類、環(huán)烯醚萜類、倍半萜類和苯乙醇類，具有降血糖、神經(jīng)保護等多種生物活性，且毒性較低；地黃能夠清熱生津、滋陰補血，并具有調(diào)節(jié)免疫力、抵抗腫瘤、延緩衰老等作用。

地黃是非模式植物，遺傳基礎(chǔ)缺乏。但是，地黃基因克隆、功能分析與表達已有報道[2-5]。地黃RghBNG基因是前期從地黃中克隆出來的全長548 bp的cDNA，包含一個282 bp的開放閱讀框，編碼1條含93個氨基酸殘基的多肽鏈；與已公布基因沒有堿基序列同源性；其編碼蛋白質(zhì)與兩組蛋白質(zhì)具有高同源性：與一組未知功能蛋白質(zhì)具有79%～86%的同源性[1]，而與另一組稱作B12D的蛋白質(zhì)具有54%～88%的同源性[3]；時空表達試驗證明其與地黃器官形成與發(fā)育有關(guān)[1]，脅迫試驗證明其與非生物脅迫應(yīng)答和生長調(diào)節(jié)劑脅迫反應(yīng)應(yīng)答有關(guān)[4]。綜上所述，RghBNG基因可能是一個多功能蛋白基因。但是，這些結(jié)果是采用生物信息學(xué)方法預(yù)測和分析以及實時定量PCR技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)錄本所獲得的，其真正的功能及作用機理有待深入研究。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因（GFP）和RghBNG基因共轉(zhuǎn)移的方法浸染懷地黃細胞，探索RghBNG基因在地黃細胞中過表達，為進一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 懷地黃品種溫85-5小植株，種植于河南師范大學(xué)試驗田，懷地黃品種溫85-5培養(yǎng)30 d組培苗，經(jīng)冷凍于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH5α和根瘤農(nóng)桿菌GV3101本實驗室保存，植物表達載體為pCAMBIA302-GFP（梁衛(wèi)紅惠贈）。

1.1.3 常用試劑、培養(yǎng)基及藥物 DNA Marker、LA Taq DNA 聚合酶、上樣緩沖液為6×Loading Buffer、氯化鈣、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Pst I和Hind III、MS培養(yǎng)基、卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）、利福平（Rif）、乙酰丁香酮（AS）、頭孢霉素和潮霉素（hyg）。

1.1.4 儀器 1000、200、20、2.5 μL可調(diào)式移液槍、SW-CJ-2D型超凈工作臺、RT-qPCR、培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱、YP202N型電子天平、紫外分光光度計、臺式超速離心機、超微量分光光度計、PCR儀、紫外分光光度計。

1.1.5 引物 RT-qPCR研究所需內(nèi)參基因TIP41引物[1]：TIP41F（5′-TGGCTCAGAGTTGATGGAGTGCT-3′）、TIP41R（5′-CTCTCCAGCAGCTTTCTCGGAGA-3′）。

RghBNG基因引物[2]：RghBNGF（5′-CGCGGAT CCATAATGGCTTCATCCACC-3′）、RghBNGR（5′-AGCATACTTCTCCCCTTCTGCAAAG-3′）。

潮霉素標(biāo)記基因引物[5]：hyg（R）F（5′-ATCGAA

ATTGCCGTCAACC-3′）、hyg（R）R（5′-ACAGCGTCT

CCGACCTGAT-3′）。

RghBNG和gfp基因的融合基因引物：RghBNGF 5′-CGCGGATCCATAATGGCTTCATCCACC-3′、gfpR 5′-TGCGCTCCTGGAGTAGC-3′（根據(jù)gfp基因3′末端堿基序列合成引物）[2]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因即地黃基因RghBNG的提取 根據(jù)張喻[2]RT-PCR技術(shù)克隆RghBNG的ORF區(qū)，提取地黃基因RghBNG目的基因。

1.2.2 構(gòu)建表達載體 用堿裂解法取pCAMBIAI302-GFP質(zhì)粒，酶切，電泳并回收目的基因和質(zhì)粒，用T4連接酶將目的基因RghBNG與載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR與酶切鑒定篩選出重組子，構(gòu)建正義表達載體。目的基因片段RghBNG的測序需要PCR產(chǎn)物與載體連接，再轉(zhuǎn)化到E.coli中進行克隆。作為克隆的E.coli受體細胞，必須是允許外源DNA進入的感受態(tài)細胞。采用CaCl2法制備感受態(tài)細胞，通過此方法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)Rif、Kan和PCR檢測后用于地黃的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.3 根瘤菌GV3101工程菌制備 ①無菌條件下在冰上凍融3管200 μL GV3101感受態(tài)細胞。②分別加入5 μL重組質(zhì)粒DNA和pCAMBIAl302質(zhì)粒，混勻。同時設(shè)置一管空對照。③冰上靜置1 min，放于液氮中速凍8 min；迅速取出，放入37 ℃水浴中溶解 5 min，冰上靜置2 min。④加入800 μL未加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min搖4 h至菌濃度為OD600 nm=0.5；之后4 000 r/min離心10 min，留200 μL菌液，用槍頭吹打混勻。⑤取100 μL菌液涂布于加有Kan和Rif抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑選抗性菌落進行PCR鑒定。

1.2.4 地黃幼葉細胞遺傳轉(zhuǎn)化與檢測 ①葉圓片法轉(zhuǎn)化：將懷地黃無菌苗的葉片剪成長寬約0.8 cm的小塊，在含植物表達載體pCAMBIAl302-RghBNG-GFP的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌液中浸泡8 min左右，用無菌濾紙吸干葉圓片，接種到MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2～3 d。②抗性愈傷誘導(dǎo)及其芽分化：將①共培養(yǎng)后的葉圓片轉(zhuǎn)接到含2.1 mg/L 6-BA、0.12 mg/L NAA、100 μmol/L的乙酰丁香酮（AS）、100 μmol/L頭孢霉素和12 mg/L潮霉素（hyg）的篩選培養(yǎng)基上，3～4周后把抗性愈傷轉(zhuǎn)接到新的篩選培養(yǎng)基上，2～3 周長出抗性芽。③再生芽生根：將長2～3 cm的抗性芽剪下轉(zhuǎn)接入含0.02 mg/L NAA和適宜質(zhì)量濃度潮霉素的生根培養(yǎng)基中生根。④再生植株的PCR檢測：提取再生植株葉片基因組DNA，利用PCR擴增已知hyg（R）基因（794 bp）、RghBNG和gfp基因的融合基因（1 298 bp），篩選抗性地黃植株。⑤抗性植株的增殖與生根：經(jīng)過④檢測陽性轉(zhuǎn)化再生地黃芽轉(zhuǎn)入含0.2 mg/L 6-BA和0.01 mg/L NAA的叢生芽分化培養(yǎng)基進行擴繁，切下增殖芽，放在③生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)溫度為25±1 ℃，光照度為 2 000 lx，光照時間為16 h/d，培養(yǎng)至試驗所用地黃苗。

1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化再生地黃苗qRT-PCR檢測 取1.2.4中⑤所獲得的陽性轉(zhuǎn)化再生地黃苗的根和葉，參照Zhou等[4]的方法進行qRT-PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃基因RghBNG的ORF的克隆

利用RT-PCR技術(shù)從張永華[1]構(gòu)建的大腸桿菌工程菌表達載體中擴增出RghBNG的ORF。電泳檢測其大約為500 bp（圖1a）。回收和純化后，測序證明其堿基組成和大小與張永華[1]報道的一致。

2.2 重組載體的構(gòu)建與檢測

用限制性內(nèi)切酶Pst I和Hind III分別酶切基因RghBNG的ORF和植物表達載體pCAMBIAl302，體外重組獲得重組質(zhì)粒pCAMBIAl302-RghBNG-GFP，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選抗性陽性菌。然后，提取其載體pCAMBIAl302-RghBNG-GFP經(jīng)Pst I和Hind III雙酶切鑒定（圖1b）和PCR驗證（圖1c）。結(jié)果顯示，雙酶切所得小片段和PCR擴增產(chǎn)物均為500 bp條帶?；厥蘸图兓?，序列分析證明其為RghBNG的ORF。endprint

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因RghBNG轉(zhuǎn)化地黃與鑒定

具有重組質(zhì)粒pCAMBIAl302-RghBNG-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV1301轉(zhuǎn)化地黃幼葉圓片，誘導(dǎo)愈傷組織、分化芽、擴繁、生根、移栽和檢測的結(jié)果如圖2所示。其中，轉(zhuǎn)化植株2、3、4和5中檢測出hyg（R）基因，約794 bp；轉(zhuǎn)化植株2、4和5中檢測出轉(zhuǎn)基因RghBNG-GFP，約1 300 bp。

2.4 基因RghBNG的過表達

任選一株取培養(yǎng)25 d的陽性地黃轉(zhuǎn)化植株，分別切取其葉和根，提取總RNA進行qRT-PCR分析，結(jié)果見表1。RghBNG基因在轉(zhuǎn)化植株幼葉中表達量最高。

3 小結(jié)與討論

地黃基因RghBNG是一種與兩類已知蛋白質(zhì)具有相當(dāng)高同源性的、不具有信號肽的功能蛋白基因。一類是一組未知功能蛋白質(zhì)，兩者的同源性高達79%～86%。另一類是B12D蛋白質(zhì)[1]，兩者的同源性達54%～88%[3]。而且RghBNG蛋白中具有B12D蛋白所具有的B12D superfamily結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在細胞膜中[3]，與重金屬脅迫和赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)劑處理有應(yīng)答反應(yīng)[4]。因此，地黃RghBNG很可能對地黃遺傳改良具有重要作用，有必要進一步研究其功能。本研究成功構(gòu)建了地黃基因RghBNG的過表達載體，獲得其轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌工程菌；用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入地黃細胞，經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得再生芽和植株，利用PCR技術(shù)檢測出一些抗潮霉素再生植株具有hyb（R）基因和RghBNG-GFP融合基因；利用qRT-PCR技術(shù)分析其在陽性轉(zhuǎn)化地黃植株的根與葉中過表達。所以，獲得的過表達基因RghBNG的地黃材料，為進一步闡明地黃基因RghBNG功能和地黃遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 張永華.地黃基因RghKAT、RghKAT、RglKAT與RghBNG的克隆和表達[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2013.

[2] 張 喻.地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗證[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2014.

[3] 周延清，王向楠，張永華，等.植物B12D基因克隆研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（6）：1-4，19.

[4] ZHOU Y Q，ZHANG Y H，WEI J，et al. Cloning and analysis of expression patterns and transcriptional regulation of RghBNG in response to plant growth regulators and abiotic stresses in Rehmannia glutinosa[J].Springer Plus，2015，4：1-8.

[5] 王豐青，田云鶴，謝彩俠，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷地黃遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].中草藥，2014，45（17）：2541-2546.endprint