張廣健,高蕊,劉群峰,崔紅纓,崔延超,付軍科

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電針對足三里穴位局部細胞外電離子濃度的影響

張廣健1,高蕊1,劉群峰2,崔紅纓1,崔延超1,付軍科1

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院,西安 710061;2.西安交通大學航空航天學院,西安 710049)

目的 觀察生理狀態(tài)下電針對穴位局部細胞外電離子濃度的影響,為探索電針穴位的作用機制提供依據(jù)。方法 選取雄性SD大鼠20只,電針大鼠足三里穴60 min(1 mA,0.2 ms,2 Hz),同時采用微透析儀于足三里穴位局部以及非穴位部位收集組織液。分子探針膜部分采樣共收集4 h,電針前生理狀態(tài)60 min、電針時60 min、電針后60 min以及電針后120 min。對所得樣品采用電解質分析方法進行即時分析,觀察足三里局部Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl-離子的濃度變化。結果 足三里穴位局部Ca﹢﹢離子濃度在電針時出現(xiàn)顯著升高(=0.003 vs電針前),此后逐步上升,至電針后60 min時穴位局部Ca﹢﹢濃度到達高峰(=0.75 vs電針時)。至電針后120 min Ca﹢﹢離子濃度出現(xiàn)下降,與電針時比較差異有統(tǒng)計學意義(=0.04)。穴位局部細胞外Na﹢及Cl﹣離子濃度在電針時亦出現(xiàn)顯著升高(＜0.001,=0.007 vs電針前)。電針后即逐步下降,至電針后60 min下降至(71.81±15.09)mmol/L與(57.42±14.30)mmol/L(=0.09,=0.07 vs電針時)。所測穴位處細胞外K﹢濃度水平表現(xiàn)出與Na﹢、Cl﹣類似的趨勢,但差異不具有統(tǒng)計學意義。電針刺激可使非穴部位細胞外Ca﹢﹢、Na﹢、K﹢以及Cl﹣離子濃度出現(xiàn)輕度升高,但是同電針前相比未見顯著性差異(＞0.05 vs電針前)。結論 電針刺激大鼠足三里可誘導穴位局部細胞外Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl﹣離子濃度出現(xiàn)明顯升高,電離子濃度在電針后不同時程出現(xiàn)下降。這為研究電針治療生理機制提供了實驗基礎。

電針;穴,足三里;細胞外電離子,穴位局部

目前電針穴位在國內外臨床治療中已獲得廣泛應用[1]。研究認為電針過程中穴位局部的變化很可能是探索其作用機制的有效切入點[2-3]。電針可能通過增加穴位局部細胞膜的離子通透性、加快通道激活速度,引起穴位局部電離子、神經(jīng)遞質等的濃度出現(xiàn)改變[4-6]。而由離子濃度改變誘發(fā)的電通訊變化,被認為是引起神經(jīng)末梢和細胞之間通訊改變的關鍵原因,是電針產(chǎn)生治療效果的生理基礎[7-8]。因此觀察電針對穴位局部的離子濃度的作用規(guī)律及特點,將為深入揭示電針的作用機制提供重要信息。本研究以電針為干預方式,采用微透析技術獲取穴位局部組織液,觀察電針對穴位處細胞外離子濃度的影響,從電離子角度為電針治療機制提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠20只,體質量(200±20)g,飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(22±3)℃和12 h光/暗周期下,自由進食和飲水,適應性喂養(yǎng)1星期。實驗是根據(jù)學校的機構動物護理委員會的指導方針進行的,所有的努力都是為了盡量減少使用動物的數(shù)量和它們的痛苦。

1.2 腧穴定位及電針

腧穴定位參考《實驗針灸學》常用實驗動物針灸穴位之大鼠常用針灸穴位[9]。足三里穴在大鼠膝關節(jié)后外側,腓骨小頭下約5 mm。旁開非穴點[10]在大鼠腓骨頭下方凹陷中的陽陵泉穴與足三里穴連線的中點,為旁開非經(jīng)非穴對照點。

大鼠套筒固定,有小孔前端通風,后肢通過2個后孔擴展。電針為直徑0.25 mm不銹鋼針,彎曲成一個“L”的形狀。電針近端由導線連接到電刺激器(HANS LH800,北京大學,中國),產(chǎn)生雙相方波。遠端插入大鼠足三里穴位,針刺深度為3 mm。電針時長為60 min (1 mA,0.2 ms,2 Hz),以大鼠下肢輕度抖動為宜[11]。

1.3 微透析操作步驟

微透析取樣采用CMA 30 Linear微透析探針(CMA Microdialysis,Stockholm,Swede),探針直徑0.24 mm,全長21 cm,透析膜長度10 mm。所用微量注射泵為CMA 100(CMA Microdialysis,Stockholm,Sweden)。分子探針膜部分采樣開始前浸入蒸餾水30 min。首先將微透析透析膜部植入足三里穴位(或非經(jīng)非穴部位)局部肌肉組織中(深度約1 mm),隨后由入口管以2mL/min速度泵入蒸餾水,平衡30 min后開始正式收集組織液(圖1)。每60 min收集得一個樣品,共收集4 h,即電針前60 min、電針時60 min、電針后60 min以及電針后120 min[12]。

注:在電針同時,進行足三里穴位以及非經(jīng)非穴部位細胞外組織液取樣。Inlet為入口管;Outlet為出口管

1.4 電離子濃度測量

采用Hitachi LABOSPECT008分析系統(tǒng)對樣品中Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl-離子濃度進行測量。采用體外回收率檢測方法對探針回收率進行檢測[13]。用微透析儀對已知濃度電離子標準品溶液進行透析,檢測透析液濃度,探針回收率=測得電離子濃度/己知標準品濃度。體內電離子濃度=測得電離子濃度/探針回收率[14]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用非配對檢驗,當方差不齊時選擇-檢驗。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 探針回收率

到目前為止,體外標準濃度與透析液濃度的比例是測定透析液回收率的標準方法[13-14]。研究體外測得標準溶液Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢、Cl﹣電離子濃度及透析液的濃度,探針回收率如表1所示。

表1 探針回收率的測定 (±s)

表1 探針回收率的測定 (±s)

電離子標準液濃度實測濃度回收率/% Ca﹢﹢8.52±0.085.74±0.7267.40 Na﹢40.90±0.2723.40±0.7057.21 K﹢25.21±0.1314.54±1.7557.68 Cl﹣26.42±0.3315.85±0.7661.22

2.2 細胞外電離子濃度測定

電針穴位局部Ca﹢﹢離子濃度在電針后出現(xiàn)顯著升高(=0.003,vs電針前),此后逐步上升,至電針后60 min時穴位局部Ca﹢﹢濃度到達高峰(=0.75,vs電針時)。至電針后120 min Ca﹢﹢離子濃度出現(xiàn)下降,與電針時比較差異有統(tǒng)計學意義(=0.04,見表2),但仍顯著高于電針前穴位局部Ca﹢﹢離子濃度水平。

穴位局部細胞外Na﹢及Cl﹣離子濃度在電針時亦出現(xiàn)顯著升高(＜0.001,=0.007 vs電針前)。此后即逐步下降,至電針后60 min下降至(71.81±15.09)與(57.42±14.30)(=0.09,=0.07 vs電針時,見表2)。所測穴位處細胞外K﹢濃度水平表現(xiàn)出與Na﹢、Cl﹣類似的趨勢。電針刺激使得穴位處細胞外K﹢濃度出現(xiàn)上升,但與電針前相比未見顯著差異(=0.43)。此后逐步下降,至電針后120 min K﹢濃度為(3.14±1.09) (=0.04 vs電針時,見表2)。電針非穴部位后,局部組織細胞外Ca﹢﹢及K﹢后離子濃度出現(xiàn)輕度升高(=0.61,=0.47 vs電針前),隨后即逐步下降。同穴位局部反應不同,電針刺激使得非穴部位Na﹢及Cl﹣離子濃度逐步下降,但是同電針前相比未見顯著性差異(=0.23,=0.35 vs電針前,見圖2)。

表2 電針對穴位局部細胞外電離子濃度影響 (±s)

表2 電針對穴位局部細胞外電離子濃度影響 (±s)

電離子電針前60 min電針時60 min電針后60 min電針后120 min Ca﹢﹢0.16±0.110.36±0.161)0.40±0.151)0.21±0.112)3) Na﹢51.53±9.3578.43±11.831)71.81±15.091)66.29±12.84 K﹢3.93±1.414.46±1.553.28±1.303.14±1.093) Cl﹣45.95±10.0461.11±12.351)57.42±14.3048.26±13.063)

注:與電針前60 min比較1)＜0.05;與電針時60 min比較2)＜0.05;與電針后60 min比較3)＜0.05

圖2 非經(jīng)非穴部位細胞外電離子濃度對比

3 討論

生物體作為一個開放的復雜系統(tǒng),是由無數(shù)個大小網(wǎng)絡相互聯(lián)系-整合而形成的。從穴位刺激到機體效應,兩者之間并不是直線性聯(lián)系,而是由體內復雜網(wǎng)絡調節(jié)系統(tǒng)介導的[5]。針刺穴位局部就存在一個能將針刺物理信息轉化為生物信息的啟動網(wǎng)絡。研究認為,離子通道和促離子型受體能直接調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性,是啟動網(wǎng)絡中的重要成員[7]。針刺刺激離子通道具有廣泛的生物學活性,是開啟機體神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡調節(jié)的重要因子[8]。本研究首次對穴位局部的多種電離子,包括Ca﹢﹢、K﹢、Na﹢以及Cl﹣的濃度進行了同步觀察,發(fā)現(xiàn)足三里穴位局部不僅存在Ca﹢﹢富集,其K﹢、Na﹢以及Cl﹣含量亦明顯高于非穴部位。提示經(jīng)絡腧穴信號傳導應是多種電離子共同作用的結果,對穴位作用的解釋應考慮多種電離子交叉作用的影響[15]。

微透析是一種從生物活體內進行動態(tài)微量生化取樣的技術。該取樣技術最大的優(yōu)勢是在基本上不干擾體內正常生命過程的情況下進行在體、實時取樣,特別適用于研究在體動態(tài)變化[16]。近年周新異等[10]、潘萍等[17]將微透析法應用于針刺效應與經(jīng)絡活動的研究中,結果表明該方法能在保持動物新陳代謝正常進行的情況下進行取樣,在真實反映針刺對動物影響方面具有應用優(yōu)勢。此次我們即采用微透析法對穴位局部以及非穴部位的細胞外電離子濃度進行測量,結果表明探針的回收率可達57.21%～67.40%,這優(yōu)于既往報道[10],可能與研究中進行微透析時所采用的不同采集參數(shù)有關。

自上世紀90年代起,人們發(fā)現(xiàn)有穴位局部Ca﹢﹢的富集現(xiàn)象,推測Ca﹢﹢可能是經(jīng)絡腧穴治療的關鍵物質[18-20]。刺激穴位能顯著增加血液中的Ca﹢﹢含量,降低尿中鈣/肌酐比值,進而影響靶器官功能[21]。當絡合Ca﹢﹢或阻斷Ca﹢﹢活動的相應環(huán)節(jié)后,針刺效應即受到很大的影響[22]。這些研究提示針刺效應與穴位Ca﹢﹢濃度改變間存在密切關系,Ca﹢﹢可能在針刺網(wǎng)絡信號的調控過程中起到了極其重要和廣泛的作用,是針刺網(wǎng)絡調節(jié)效應的重要節(jié)點[7]。此次我們采用微透析技術動態(tài)觀察電針對穴位部位細胞外Ca﹢﹢濃度進行在體動態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)電針能引起穴位局部Ca﹢﹢離子濃度出現(xiàn)顯著升高,且該效應持續(xù)至電針120 min后Ca﹢﹢離子濃度始出現(xiàn)下降,但穴位局部Ca﹢﹢濃度仍顯著高于電針前水平。我們考慮這種效應產(chǎn)生的原因可能是穴位處受針刺刺激后引起局部結締組織牽張,釋放Ca﹢﹢至細胞間隙[23];電針刺激增強細胞膜的通透性,促使Ca﹢﹢從細胞內進入細胞外[24];外加電場可引起細胞膜去極化或超極化,產(chǎn)生動作電位,導致Ca﹢﹢外流[25]。本研究同時對非穴部位進行觀察,發(fā)現(xiàn)電針非穴部位僅使得局部Ca﹢﹢濃度輕度升高,隨后即逐步下降,提示這種電針刺激引起的Ca﹢﹢濃度的顯著升高是穴位特異性的。這種電針引起的穴位局部Ca﹢﹢濃度持續(xù)性升高,不僅可以引起肌肉收縮,促進神經(jīng)元放電,還可激活肥大細胞,促使肥大細胞脫顆粒[8,23]。而研究人員早在50年代就發(fā)現(xiàn)過敏介質組胺的釋放需要Ca﹢﹢的存在,認為Ca﹢﹢是組胺釋放的必需條件。這種Ca﹢﹢濃度升高誘發(fā)的多種神經(jīng)內分泌系統(tǒng)介質的相互作用,被認為是最終作用于靶器官,發(fā)揮針灸調節(jié)作用的關鍵步驟[26-27]。

正常組織中,細胞內外Na﹢和K﹢存在著顯著的離子梯度,為維持細胞的電位起著非常重要的作用[4-5]。電針刺激穴位可能對細胞內外Na﹢和K﹢含量產(chǎn)生影響,通過改變細胞膜Na﹢和K﹢通道激活速度與細胞電位,影響鄰近細胞功能。研究發(fā)現(xiàn),艾灸足三里可使得局部K﹢濃度在灸后60 min時顯著升高,考慮艾灸引起的K﹢通道功能改變亦是艾灸發(fā)生效應的始動環(huán)節(jié)之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)電針后穴位局部組織液中隨著Ca﹢﹢濃度增高,Na﹢和K﹢含量亦出現(xiàn)明顯升高。此后隨著升高的Na﹢和K﹢濃度回落,細胞間隙內Ca﹢﹢濃度也在電針后120 min逐步下降。我們推測電針刺激中針刺牽拉刺激作用外加電場影響,使得Na﹢和K﹢通道電流增加,引起Na﹢和K﹢大量外流。而這種電針打破穴位局部穩(wěn)態(tài),引起Na﹢和K﹢通道功能開放,可能進一步加快Ca﹢﹢通道激活速度,從而促進細胞內Ca﹢﹢持續(xù)加速外流。我們考慮這種多種電離子濃度改變的交互作用可能是電針穴位治療的生理基礎,但其具體作用機制有待進一步研究。下一步我們將對電針穴位局部電離子相關通道的影響進行探索。

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Effect of Electroacupuncture on Local Extracellular Ionized Atom Concentrations at Point Zusanli (ST36)

-1,1,-2,-1,-1,-1.

1.’,’710061,; 2.’,’710049,

Objective To investigate the effect of electroacupuncture on acupoint local extracellular ionized atom concentrations under physiological status and provide a basis for exploring the mechanism of action of electroacupuncture. Method Twenty male SD rats were selected. Rat point Zusanli (ST36) was given electroacupuncture (1 mA, 0.2 ms and 2 Hz) for 60 min. Meanwhile, local tissue fluid was collected at point Zusanli and non-acupoints using a microdialyzer. The collection by molecular probe membrane sampling lasted 4 hrs: 60 min physiological status before electroacupuncture, 60 min electroacupuncture, 60 min after electroacupuncture and 120 min after electroacupuncture. Real-time analysis of the sample was made by electrolyte analysis to observe local changes in concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-at point Zusanli. Result Local Ca﹢﹢concentrations at point Zusanli increased significantly during electroacupuncture (=0.003, vs before electroacupuncture), rose gradually afterwards and reached the peak at 60 min after electroacupuncture (=0.75, vs during electroacupuncture). Ca﹢﹢concentrations decreased at 120 min after electroacupuncture; there was a statistically significant difference compared with during electroacupuncture (=0.04). Acupoint local extracellular concentrations of Na﹢and Cl-also increased significantly during electroacupuncture (＜0.001,=0.007, vs before electroacupuncture) but decreased gradually during 60 min after electroacupuncture and to (71.81±15.09) mmol/L and (57.42±14.30) mmol/L, respectively, at 60 min after electroacupuncture (=0.09,=0.07 vs during electroacupuncture). Acupoint extracellular K﹢concentrations had a tendency similar to those of Na﹢and Cl-but there was no statistically significant difference. Non-point electroacupuncture slightly increased extracellular concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-but there were no statistically significant differences compared with before electroacupuncture (＞0.05). Conclusion Rat point Zusanli electroacupuncture can induce significant increases in acupoint local extracellular concentrations of Ca﹢﹢, K﹢, Na﹢and Cl-. Ionized atom concentrations decrease in different degrees after electroacupuncture. These provide an experimental basis for studying the physiological mechanism of electroacupuncture treatment.

Electroacupuncture; Point, Zusanli (ST36); Extracellular ionized atom; Local acupoint

1005-0957(2017)08-0999-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.08.0999

2017-02-20

國家自然科學基金項目(81302917)

張廣健(1979—),男,副主任醫(yī)師,博士,Email:michael8039@163.com

高蕊(1980—),女,副主任醫(yī)師,博士,Email:jacky_mg@163.com