邢振楠 孟慶彬 王丹麗 范冬茹 馬 珂

（伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 伊春 153000）

產(chǎn)木聚糖酶的食用真菌菌株選育及條件優(yōu)化*

邢振楠 孟慶彬 王丹麗 范冬茹 馬 珂

（伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江 伊春 153000）

采用木聚糖類似物誘導(dǎo)法，對(duì)64種食用真菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到產(chǎn)木聚糖酶較高的食用菌株—黑木耳LK8。利用正交試驗(yàn)法對(duì)黑木耳LK8的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：在液體培養(yǎng)基pH=7.5、底物木聚糖濃度為1 g/100mL、培養(yǎng)20天的條件下產(chǎn)酶效果最佳，產(chǎn)酶水平為605.6 IU/mL，較優(yōu)化前提高近7倍。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果證明培養(yǎng)液pH值是影響誘導(dǎo)效果的主要因素，利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，得率為43%。

木聚糖酶；食用真菌；誘導(dǎo)代謝；條件優(yōu)化

木聚糖酶是一類能夠破壞植物纖維組織，降解半纖維素的一組酶的總稱，屬于水解酶、胞外酶類，具有可誘導(dǎo)性。目前已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、動(dòng)物飼料喂養(yǎng)、食品行業(yè)加工、能源開發(fā)、環(huán)境綜合治理、造紙行業(yè)以及功能性低聚糖制備等領(lǐng)域[1-2]。木聚糖酶產(chǎn)生菌主要來(lái)源于自然菌株，可通過(guò)誘變、蛋白質(zhì)工程、基因工程等分子技術(shù)改變產(chǎn)酶基因，從而提高菌體木聚糖酶的分泌量。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在利用工程化菌株生產(chǎn)木聚糖酶[3-6]，而利用大型食用真菌液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶卻鮮有報(bào)道。因此，本研究用7種木聚糖結(jié)構(gòu)類似物配制液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)64株不同種的大型食用真菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以期篩選出產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的菌株，并確定最佳產(chǎn)木聚糖酶條件。同時(shí)，制備粗酶制劑，為木聚糖酶生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為其理化性質(zhì)研究做準(zhǔn)備。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種

64種大型食用真菌包括9株木耳 (黑木耳LK5、黑木耳 LK7、黑木耳 LK916、黑木耳 LK9、黑木耳LK10、黑木耳LK12、黑木耳LK15、黑木耳LK8、黑木耳—豐收)、16株香菇 (香菇L26、香菇L109、香菇 9608、香菇 2205、香菇 2206、香菇 939、福建 396、香菇 1363、香菇 856、香菇 236、香菇396、香菇 208、香菇 908、香菇美 236、香菇美 238、平菇洛加)、11 株靈芝(靈芝 s1、靈芝 s2、靈芝 s3、靈芝 s4、靈芝 s5、靈芝 s6、靈芝 s7、靈芝 s8、靈芝 s9、韓靈芝、紅靈芝)及28株其他品種大型真菌(硫磺菌、金耳、白靈菇、灰離、長(zhǎng)根菇、杏鮑菇、血耳、大宗菇、豬苓、羊肚菇、柴臉菇、榆黃蘑、大球蓋菇、褶傘密環(huán)菌、灰樹花、塊根蘑、元蘑、白靈菇、玉田平菇、猴頭、茶樹菇、滑子菇、真姬菇、向陽(yáng)2號(hào)、白金鎮(zhèn)、黃金針、華白平菇、茯苓)。

1.2 供試培養(yǎng)基及主要化學(xué)試劑

液體培養(yǎng)基(蛋白胨 2.0 g，酵母膏 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO41.0 g,KH2PO40.46 g)、木聚糖類似物(木聚糖、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉(CMCNa)、葡萄糖、木糖、微晶纖維素、可溶性淀粉)，3,5—二硝基水楊酸(DNS)試劑、檸檬酸—磷酸二氫鈉緩沖液(pH5)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 食用真菌液體培養(yǎng)

將培養(yǎng)基與7種木聚糖類似物（添加量為5 g/L）分別組合成為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別將64種食用菌接種到培養(yǎng)基內(nèi)，設(shè)置pH值為7.0，25℃、150 r/min的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)25天，測(cè)定培養(yǎng)后的酶活并比較產(chǎn)酶能力。

2.2 食用真菌產(chǎn)木聚糖酶的測(cè)定

采用透明圈快速檢測(cè)法[7]。篩選具有木聚糖酶的食用真菌菌株，DNS法[8]測(cè)量食用菌培養(yǎng)液的產(chǎn)木聚糖酶活力(1mL酶液在50℃，pH值5.0條件下，每分鐘水中木聚糖生成1μmol木糖還原物質(zhì)的量定為1個(gè)酶活單位，以IU/mL表示)。

2.3 木聚糖類似物誘導(dǎo)法培養(yǎng)條件的優(yōu)化

利用正交試驗(yàn)法對(duì)黑木耳LK8的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，選用Lg(33)正交表，擬定的正交試驗(yàn)因素與水平(表1)。

表1 試驗(yàn)因素與水平表

2.4 粗酶制劑的保存

把經(jīng)過(guò)鹽析、濃縮后得到的木聚糖粗酶用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，得到粗酶制劑，為下一步木聚糖酶理化性質(zhì)研究做準(zhǔn)備。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

通過(guò)透明圈快速檢測(cè)法初步檢測(cè)出48株食用真菌具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，進(jìn)一步通過(guò)DNS法檢測(cè)出，在不同誘導(dǎo)類似物誘導(dǎo)培養(yǎng)下，產(chǎn)木聚糖酶活力較高的5個(gè)食用真菌菌株分別是：香菇2205、靈芝、杏鮑菇、玉田平菇、黑木耳 LK8（表 2）。綜合各特征比較，黑木耳LK8透明圈直徑最大，DNS（OD600nm）數(shù)值高于其他菌株，在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出較好的產(chǎn)木聚糖酶能力。因此最終選取伊春林業(yè)科學(xué)院保藏菌種黑木耳LK8進(jìn)行液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)。

3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由正交試驗(yàn)結(jié)果分析（表3）可知：誘導(dǎo)培養(yǎng)黑木耳LK8產(chǎn)木聚糖酶最高的條件組合為a1b3c3，即最佳培養(yǎng)時(shí)間、pH值和底物木聚糖濃度（g/100mL）分別為20天、7.5和1 g/100mL；優(yōu)化后測(cè)定產(chǎn)酶水平為：605.6 IU/mL。

由極差數(shù)據(jù)分析(表4）可知：黑木耳LK8受各因素影響的順序是，誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH＞底物濃度＞誘導(dǎo)時(shí)間，其中pH值是主要因素。

表2 5種菌種經(jīng)不同誘導(dǎo)處理產(chǎn)木聚糖酶情況

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表4 極差分析表

3.3 木聚糖酶提取結(jié)果

通過(guò)對(duì)黑木耳LK8的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，酶活力得到了很大的提高，較之前的Themr ascusaurantaicus優(yōu)化菌株[9]有較高的酶活及產(chǎn)率(表5)，利用鹽沉和冷凍干燥法，每1 000mL粗酶液可得到3.581粗酶粉，單位酶活為72 050.8 IU/g，總酶活為258 013.9 IU，得率為43%。

表5 黑木耳LK8木聚糖酶制劑的酶活力和得率

4 討論與結(jié)論

4.1 誘導(dǎo)菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化是誘導(dǎo)食用菌代謝生產(chǎn)木聚糖酶的關(guān)鍵技術(shù)，本試驗(yàn)對(duì)64株大型食用真菌采用平板透明圈法和液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)相結(jié)合的方法，篩選獲得1株產(chǎn)木聚糖酶較高的菌株，為黑木耳LK8。通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)菌株黑木耳LK8的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)時(shí)間20天、pH值7.5、底物木聚糖濃度1 g/100mL。條件優(yōu)化后菌株LK8產(chǎn)酶水平從原來(lái)的86.2 IU/mL提高到605.6 IU/mL，提高了近7倍；同時(shí)得出影響誘導(dǎo)效果的主要因素是培養(yǎng)液pH值；利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，每1 000mL粗酶液得3.581 g粗酶粉，單位酶活為72 050.8 IU/g，總酶活為258 013.9 IU,得率為43%。利用此誘導(dǎo)培養(yǎng)方法合成的木聚糖酶偏堿性，具有更廣闊的研究潛力和應(yīng)用前景。

4.2 研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中食用菌菌絲體對(duì)培養(yǎng)基酸堿度要求差別很大，后續(xù)將就食用菌代謝生產(chǎn)的木聚糖的理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，確定其理化性質(zhì)及應(yīng)用范圍，為木聚糖酶的應(yīng)用積累數(shù)據(jù)。

4.3 試驗(yàn)過(guò)程中菌絲生長(zhǎng)前期產(chǎn)多糖比率較高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)多糖比率有所下降，產(chǎn)酶能力則是隨菌絲代謝時(shí)間延長(zhǎng)而增加，平衡產(chǎn)酶和產(chǎn)多糖時(shí)間點(diǎn)，是后續(xù)的主要研究?jī)?nèi)容。

4.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基質(zhì)中的木聚糖類似物可誘導(dǎo)該酶的合成、增加該酶代謝量，此試驗(yàn)正是基于利用食用菌生長(zhǎng)代謝特性與木聚糖酶的合成特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。我國(guó)食用菌產(chǎn)量大，液體培養(yǎng)技術(shù)成熟，所以，探究大型食用真菌的深層研究?jī)r(jià)值，利用其生產(chǎn)木聚糖酶及相關(guān)酶系將成為未來(lái)科研的一個(gè)主要方向。

［1］ 郭清吉.木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建與篩選［D］.青島科技大學(xué),2008(6).

［2］ 王宜磊,鄧振旭.透明圈法快速篩選半纖維素分解菌［J］.生物技術(shù),2000,10(1):37-39.

［3］ MalabadiRB,Raghvendra S,Kumar SV.Production of cellulosefree xylanase from a novel yeast used for biobleaching in paper industry.Research JournalofMicrobiology,2007.2(1):24-33.

［4］ Gigi C,Adina C,Gabriela E.Optimization of biosynthesis conditions and catalytic behavior evaluation of cellulose-free xylanase produced by a new Streptomyces sp. Strain.AUDJC-Food Technology,2011.36(1):34-44.

［5］ 于俊杰,赫榮琳,武改紅,等.復(fù)合木質(zhì)纖維素酶菌株篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通報(bào),2013(4):101-109.

［6］ 李里特,丁長(zhǎng)河,江正強(qiáng),等.一株產(chǎn)木聚糖酶鏈霉菌的鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶［J］.微生物學(xué)通報(bào),2003,30(6):59-64.

［7］ 王宜磊,鄧振旭.透明圈法快速篩選半纖維素分解菌［J］.生物技術(shù),2000,10(1):37-39.

［8］ 沈誠(chéng),李戎,胡婷莉,等.木聚糖酶活力的二硝基水楊酸（DNS）測(cè)定法［J］.印染,2011(2):35-39.

［9］ 韓曉芳,鄭連爽.產(chǎn)木聚糖酶嗜堿細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2002,3(11):25-27.

［10］ 邢振楠，臧海蓮，王丹麗，等.誘導(dǎo)食用真菌代謝生產(chǎn)木聚糖酶的研究［J］.5(13):8-11，73.

（責(zé)任編輯：李 丹）

S 567.3

A

1001-9499（2017）05-0022-03

* 黑龍江省森林工業(yè)總局科技攻關(guān)項(xiàng)目（sgzjY2013015）

第1作者簡(jiǎn)介：邢振楠（1981-），男，本科，工程師。 主要從事森林食品研究。

2017-05-29