馬 靜,鄭照明,王朝朝,杜 佳,李 軍*

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抗生素對厭氧氨氧化顆粒污泥脫氮性能的影響

馬 靜1,鄭照明1,王朝朝2,杜 佳1,李 軍1*

(1.北京工業(yè)大學(xué),北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程重點實驗室,北京 100124；2.河北工程大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院,河北邯鄲056038)

通過血清瓶批試實驗,研究了3種具有不同抑制機理的抗生素(青霉素G鈉、土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E)對厭氧氨氧化顆粒污泥脫氮性能的短期抑制特性.不添加抗生素時,厭氧氨氧化顆粒污泥的NH4+-N和NO2--N降解速率分別為0.252,0.375kg N/(kg VSS·d).濃度為3000mg/L的青霉素G鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用較小.土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用較強.土霉素鹽酸鹽濃度分別為50,100,150,200,400mg/L實驗組的NH4+-N降解速率分別為0.250,0.237,0.200,0.117,0.062kg N/(kg VSS·d); NO2--N降解速率分別為0.324,0.304,0.296,0.244,0.069kg N/(kg VSS·d).硫酸多粘菌素E濃度分別為30,70,90,100,300mg/L實驗組的NH4+-N降解速率分別為0.230,0.134,0.094,0.022,0.007kg N/(kg VSS·d); NO2--N降解速率分別為0.351,0.203,0.133,0.039,0.004kg N/(kg VSS·d).青霉素G鈉、土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的抑制作用依次增強.

厭氧氨氧化；顆粒污泥；抗生素；批試實驗；抑制作用

抗生素類生物制藥廢水和畜禽養(yǎng)殖業(yè)廢水中含有較高濃度的有機物、氨氮和抗生素[1-2].目前國內(nèi)應(yīng)用的抗生素廢水處理技術(shù)基本以生物法為主,并輔助以物理、化學(xué)方法.不同種類抗生素對微生物的抑制機理不同,其中青霉素、先鋒霉素、環(huán)絲氨酸和萬古霉素等可干擾細胞壁的合成;四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素和鏈霉素等可干擾核糖體的蛋白質(zhì)合成;多粘菌素可破壞細胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)[3-4].厭氧氨氧化作為一種新型的生物脫氮工藝,有助于減少脫氮過程中碳源的投加和能源的浪費[5].但是厭氧氨氧化菌生長速度慢、細胞產(chǎn)率低、倍增時間長達(11d),對環(huán)境條件要求極為苛刻[6].批試裝置和連續(xù)流反應(yīng)器研究抗生素對厭氧氨氧化菌活性的短期和長期抑制特性表明,青霉素G對厭氧氨氧化菌活性的短期抑制作用較小,對厭氧氨氧化菌活性的長期抑制作用強烈[7].土霉素對厭氧氨氧化活性的短期與長期抑制特性和青霉素類似[8-9].到目前為止,不同種類抗生素對厭氧氨氧化菌活性抑制特性的系統(tǒng)性研究較少.此外,厭氧氨氧化顆粒污泥中厭氧氨氧化菌密度和胞外聚合物含量較高,對不利環(huán)境具有較好的耐受能力,在工程中的應(yīng)用較多,有必要就不同種類抗生素對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的抑制特性進行研究[10].

本研究通過批試實驗同時考察不同抑制特性的抗生素(青霉素、土霉素和硫酸多粘菌素)對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的短期抑制特性,以期了解不同抑制特性的抗生素對厭氧氨氧化顆粒污泥的抑制毒性,為厭氧氨氧化工藝處理抗生素廢水提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 厭氧氨氧化顆粒污泥來源

厭氧氨氧化顆粒污泥取自實驗室已穩(wěn)定運行的UASB-生物膜反應(yīng)器底部.有效容積為10L,采用黑色軟性材料包裹以避光,反應(yīng)器上方2/3部分添加直徑為10cm的聚氯乙烯球形填料以減少污泥的流失.進水NH4+-N濃度為40~50mg/L, NO2--N濃度為50~60mg/L,其余組分和微量元素控制參照文獻[11].反應(yīng)器溫度控制為28~30℃,進水由濃水和未經(jīng)消氧的自來水組成,溶解氧為3~4mg/L, HRT為1.5h, TN平均去除率為78.87%, TN平均容積去除負荷為1.5kg/(m3·d).污泥經(jīng)測序,主要厭氧氨氧化菌種類為Candidatus Brocadia fulgida (JX852965-JX8 52969).厭氧氨氧化顆粒污泥取出后,先用自來水沖洗3遍以去除表面的殘留基質(zhì),顆粒污泥呈磚紅色,粒徑為2~3mm.

1.2 批試實驗

1.2.1 批試實驗水質(zhì) 批試實驗采用人工配水,主要氮素成分為NH4Cl和NaNO2.初始NH4+-N和NO2--N濃度分別為70,80mg/L.實驗所用的抗生素種類分別為青霉素G鈉、土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E(購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司),均達到USP級,濃度按需添加.

1.2.2 批試實驗裝置與步驟 批試實驗采用500mL血清瓶(圖1),污泥濃度的確定:用分析天平稱取14g左右濕污泥,將污泥和模擬配水一起放入血清瓶中.同時取5g左右濕污泥用濾紙包好,經(jīng)烘箱和馬弗爐處理,烘干時間及溫度同常規(guī)污泥濃度測量條件相同,得到干物質(zhì)/濕泥、揮發(fā)性物質(zhì)/濕泥的比值,反算血清瓶中的MLSS和MLVSS.

厭氧氨氧化活性的測定參照文獻[12-13],為了保證厭氧氨氧化顆粒污泥的活性,進行如下操作: (1)配置泥水混合液; (2)啟動恒溫磁力攪拌器,轉(zhuǎn)速為200r/min,蓋緊瓶塞,通氮氣30min(氮氣純度99.999%); (3)停止通氮氣,將血清瓶連同磁力攪拌器放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中.每隔一定時間取樣測定NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度,每次取樣體積5mL.

1.3 分析方法

NH4+-N:納氏試劑光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:麝香草酚分光光度法;MLSS、MLVSS:重量法;DO、溫度: WTW/Multi 3420測定儀.

2 結(jié)果與討論

2.1 不添加抗生素實驗組厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮活性

由圖2可見,顆粒污泥表現(xiàn)出良好的厭氧氨氧化活性.初始NH4+-N和NO2--N濃度都為70mg/L左右,隨著反應(yīng)的進行, NH4+-N和NO2--N濃度逐漸降低, NO3--N濃度逐漸上升. △NO2--N/△NH4+-N(摩爾比)=1.47, △NO3--N/ △NH4+-N(摩爾比)=0.34,和Strous等[6]的研究結(jié)果相近.厭氧氨氧化批試NH4+-N和NO2--N降解速率分別為0.252,0.375kg N/(kg VSS·d).

2.2 青霉素G鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥脫氮活性的影響

由圖3可見,當(dāng)青霉素G鈉濃度高于400mg/ L時,采用納氏試劑光度法測得的NH4+-N濃度高于批試實驗所配置的NH4+-N濃度,推測青霉素G鈉與納氏試劑反應(yīng),對NH4+-N的測定造成干擾,故不再討論NH4+-N的降解過程.但是批試過程中NO2--N的降解以及NO3--N的生成過程均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,對底物轉(zhuǎn)化過程進行線性擬合.不同青霉素G鈉濃度作用下厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮活性如表1所示.青霉素G鈉濃度分別為100,400,1000,2000,3000mg/L實驗組NO2--N的降解速率相差不大,分別為0.346,0.382, 0.405,0.387,0.402kg N/(kg VSS·d) (圖3a); NO3-- N的生成速率分別為0.100,0.094,0.088,0.076, 0.070kg N/(kg VSS·d) (圖3b).從NO2--N的降解速率和NO3--N的生成速率可以看出,青霉素G鈉濃度對對顆粒污泥厭氧氨氧化活性的影響較小.

Van de Graaf等[14]的批試研究表明,濃度為0~100mg/L的青霉素對污泥的厭氧氨氧化活性抑制作用較小.Jetten等[15]的批試研究表明,當(dāng)青霉素G濃度小于1000mg/L時,厭氧氨氧化菌的活性沒有受到影響.Hu等[7]通過批試裝置和連續(xù)流反應(yīng)器系統(tǒng)地研究了青霉素G鉀對厭氧氨氧化絮體污泥活性的短期和長期抑制特性.他們采用絮體污泥進行研究的原因是厭氧氨氧化顆粒污泥中可能存在青霉素降解菌,而且顆粒污泥表面的蛋白質(zhì)對青霉素的傳質(zhì)可能具有阻礙作用.結(jié)果表明在批試裝置中,濃度為0~2000mg/L的青霉素G鉀對厭氧氨氧化菌的活性影響較小;在連續(xù)流反應(yīng)器中,濃度為500~5000mg/L的青霉素G鉀對厭氧氨氧化菌的活性具有強烈抑制作用.本研究的批試實驗表明,青霉素G鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性影響較小,和前人的研究報道一致[7,15].青霉素是-內(nèi)酰胺類窄譜抗生素,主要抑制革蘭氏陽性菌,作用機制為抑制轉(zhuǎn)肽酶和細胞壁上肽聚糖的合成[16].厭氧氨氧化菌屬于浮霉菌門,細胞壁不含肽聚糖,所以批試實驗中青霉素G鈉對厭氧氨氧化活性的影響較小[17].但是, Hu等[7]的研究表明,青霉素G鉀對厭氧氨氧化菌的生長和蛋白質(zhì)合成具有一定的抑制作用,由于厭氧氨氧化菌的生長速率較慢,倍增時間長度11d,所以批試實驗中青霉素G鉀對厭氧氨氧化菌的活性沒有明顯抑制作用;而在連續(xù)流實驗中,污泥的厭氧氨氧化活性受到抑制.最近關(guān)于厭氧氨氧化菌宏基因組的資料顯示,厭氧氨氧化菌的基因組中存在編碼肽聚糖合成以及肽聚糖結(jié)合蛋白的基因[18].因此,在長期運行中,青霉素G可能通過抑制肽聚糖的合成從而抑制厭氧氨氧化菌的活性.青霉素G鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的長期抑制特性有待于進一步研究.

表1 不同濃度青霉素G鈉條件下的厭氧氨氧化活性

2.3 土霉素鹽酸鹽對厭氧氨氧化顆粒污泥脫氮活性的影響

由圖4可見,批試過程中NH4+-N和NO2--N的降解以及NO3--N的生成過程均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,對底物轉(zhuǎn)化過程進行線性擬合.不同土霉素鹽酸鹽濃度作用下厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮活性如表2所示.土霉素鹽酸鹽濃度分別為50,100,150,200,400mg/L實驗組的NH4+-N降解速率分別為0.250,0.237,0.200,0.117,0.062kg N/(kg VSS·d) (圖4a); NO2--N的降解速率分別為0.324,0.304,0.296,0.244,0.069kg N/(kg VSS·d) (圖4b); NO3--N的生成速率分別為0.076,0.061, 0.057,0.035,0.011kg N/(kg VSS·d) (圖4c).從NH4+-N和NO2--N的降解速率可以看出,低濃度土霉素對顆粒污泥的厭氧氨氧化活性抑制作用較小;高濃度土霉素對顆粒污泥的厭氧氨氧化活性抑制作用強烈.和未添加抗生素實驗組相比,土霉素鹽酸鹽濃度分別為50,100,150,200,400mg/L實驗組的厭氧氨氧化亞硝態(tài)氮降解速率分別下降了13.6%、18.8%、21.1%、35.0%和81.7%.

表2 不同濃度土霉素鹽酸鹽條件下的厭氧氨氧化活性

和土霉素對厭氧氨氧化污泥的長期抑制特性相比,厭氧氨氧化污泥對土霉素短期抑制的耐受能力較強. Noophan等[19]的研究表明,在批試裝置中,濃度為10~100mg/L的土霉素對厭氧氨氧化污泥的活性具有強烈的抑制作用.在連續(xù)流反應(yīng)器中,控制土霉素濃度為5mg/L,經(jīng)過5周時間,污泥的厭氧氨氧化活性被完全抑制. Yang等[8]的研究表明,厭氧氨氧化顆粒污泥對土霉素具有良好的耐受能力.在批試實驗中,土霉素對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的半抑制濃度(IC50)為517.5mg/L;在連續(xù)流實驗中,厭氧氨氧化顆粒污泥對土霉素的耐受能力降低,當(dāng)進水中的土霉素濃度為50mg/L時,經(jīng)過26d,反應(yīng)器的總氮去除容積負荷從12.0降低到2kg N/(m3·d),厭氧氨氧化顆粒污泥的活性從16.3降低到1.6mg TN/(g VSS·h). Lotti等[9]的批試研究表明土霉素對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的半抑制濃度(IC50)為1100mg/L;在長期抑制實驗中,控制土霉素濃度為100mg/L,經(jīng)過14d,厭氧氨氧化顆粒污泥的活性下降至初始活性的75%.土霉素屬于四環(huán)類抗生素,研究表明四環(huán)素的主要作用機制是特異性地與核糖體30S亞基的A位置結(jié)合,阻止氨?；?tRNA進入A位,破壞核聚糖體形成,從而抑制細菌的生長[9].本研究的厭氧氨氧化顆粒污泥粒徑約為2~3mm,對土霉素鹽酸鹽的耐受能力和Yang等[8]的研究結(jié)果相近.厭氧氨氧化顆粒污泥對土霉素的抑制作用具有較強的耐受能力,其可能的原因分析如下:首先,顆粒污泥粒徑對底物的傳質(zhì)具有阻礙作用,有助于緩解土霉素對厭氧氨氧化菌的抑制作用[20].其次,Tang等[21]的研究表明,厭氧氨氧化顆粒污泥表面具有大量的胞外聚合物,電負性較強,可以對溶液中的有毒物質(zhì)進行吸附,從而緩解有毒物質(zhì)對厭氧氨氧化菌的抑制作用.此外, Tan等[22]的研究表明,在高度聚集的條件下,微生物的基因表達能力更強,對不利環(huán)境的適應(yīng)能力更強.顆粒污泥中厭氧氨氧化菌的聚集密度較高,可能有助于緩解土霉素對厭氧氨氧化菌的抑制作用.

2.4 硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥脫氮活性的影響

由圖5可見,NH4+-N和NO2--N的降解以及NO3--N的生成過程均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,對底物轉(zhuǎn)化線性階段進行直線擬合.不同硫酸多粘菌素E濃度作用下厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮活性如表3所示.硫酸多粘菌素E濃度分別為30,70,90,100,300mg/L實驗組的NH4+-N降解速率分別為0.230,0.134,0.094,0.022,0.007kg N/(kg VSS·d) (圖5a); NO2--N的降解速率分別為0.351, 0.203,0.133,0.039,0.004kg N/(kg VSS·d) (圖5b); NO3--N的生成速率分別為0.062,0.043,0.025, 0.022,0.010kg N/(kg VSS·d) (圖5c).和未添加抗生素實驗組相比,硫酸多粘菌素E濃度分別為30,70,90,100,300mg/L實驗組的厭氧氨氧化亞硝態(tài)氮降解速率分別下降了6.2%、45.7%、64.4%、89.6%和98.9%.

Ding等[23]的批試研究結(jié)果表明,硫酸多粘菌素B對污泥厭氧氨氧化活性的半抑制濃度(IC50)為10.2mg/L.多粘菌素是從多粘桿菌培養(yǎng)液中獲得的多肽類抗生素,對多數(shù)革蘭氏陰性桿菌有殺滅作用.多粘菌素含有帶正電荷的游離氨基,能與革蘭氏陰性菌細胞膜的磷脂中帶負電荷的磷酸根結(jié)合,使細菌細胞膜面積擴大,通透性增加,細胞內(nèi)的磷酸鹽、核苷酸、氨基酸等成分外漏,導(dǎo)致細菌死亡.本研究未添加抗生素實驗組批試結(jié)束后的溶液無色透明,但是硫酸多粘菌素E為300mg/L實驗組批試結(jié)束后的溶液呈淡紅色,可能的原因是高濃度的硫酸多粘菌素E使厭氧氨氧化菌的細胞膜通透性增加,細胞內(nèi)的血紅素等成分外漏[1,24-25].本研究硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥的抑制毒性低于Ding等[23]的研究結(jié)果.可能的原因是本研究采用厭氧氨氧化顆粒污泥,顆粒污泥粒徑對硫酸多粘菌素E的傳質(zhì)阻礙、顆粒污泥表面EPS對硫酸多粘菌素E的吸附和厭氧氨氧化菌的高度聚集狀態(tài)有助于緩解硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化菌的抑制作用[20-22].

表3 不同濃度硫酸多粘菌素E條件下的厭氧氨氧化活性

3 結(jié)論

3.1 在批試實驗中,青霉素G鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用較小.青霉素G鈉濃度分別為0,100,400,1000,2000,3000mg/L實驗組的厭氧氨氧化亞硝態(tài)氮的降解速率相差不大,分別為0.375,0.346,0.382,0.405,0.387,0.402kg N/(kg VSS·d).

3.2 在批試實驗中,土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用較強.和未添加抗生素實驗組相比,土霉素鹽酸鹽濃度分別為50,100,150,200,400mg/L實驗組的厭氧氨氧化亞硝態(tài)氮降解速率分別下降了13.6%, 18.8%,21.1%,35.0%,81.7%;硫酸多粘菌素E濃度分別為30,70,90,100,300mg/L實驗組的厭氧氨氧化亞硝態(tài)氮降解速率分別下降了6.2%,45.7%, 64.4%,89.6%,98.9%.

3.3 青霉素G鈉、土霉素鹽酸鹽和硫酸多粘菌素E對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用依次增強.在批試實驗中,厭氧氨氧化顆粒污泥對3種不同抑制特性的抗生素具有較好的耐受能力,這些抗生素對厭氧氨氧化菌活性的長期抑制作用、菌體的自我保護機制以及微生物群落變化規(guī)律有待進一步研究.

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Effect of antibiotics on the nitrogen removal performance of anammox granules.

MA Jing1, ZHENG Zhao-ming1, WANG Zhao-zhao2, DU Jia1, LI Jun1*

(1.Beijing Key Laboratory of Water Science and Water Environmental Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.College of Urban Construction, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China).

The inhibition effect of three different kinds of antibiotics on the nitrogen removal performance of anammox granules was investigated by serum bottle batch tests. The antibiotics used in the experiment were penicillin G sodium, oxytetracycline HCl and polymyxin E sulphate, which performed different inhibition mechanisms. As a result, when the batch test was conducted without the addition of antibiotic, the NH4+-N and NO2--N removal rates of the anammox granules were 0.252 and 0.375kg N/(kg VSS·d), respectively. Besides, the anammox activity of the granules was not inhibited with the penicillin G sodium concentration of 3000mg/L. However, the anammox activity of the granules was largely inhibited by oxytetracycline HCl and polymyxin E sulphate. With the oxytetracycline H

oncentrations of 50, 100, 150, 200 and 400mg/L, the NH4+-N removal rates were 0.250, 0.237, 0.200, 0.117 and 0.062kg N/(kg VSS·d), respectively; The NO2--N removal rates were 0.324, 0.304, 0.296, 0.244 and 0.069kg N/(kg VSS·d), respectively. Meanwhile, with the polymyxin E sulphate concentrations of 30, 70, 90, 100 and 300mg/L, the NH4+-N removal rates were 0.230, 0.134, 0.094, 0.022 and 0.007kg N/(kg VSS·d), respectively; The NO2--N removal rates were 0.351, 0.203, 0.133, 0.039 and 0.004kg N/(kg VSS·d), respectively.The inhibition effects of the three kinds of antibiotics were in the order as follows: polymyxin E sulphate>oxytetracycline HCl>penicillin G sodium.

anammox；granules；antibiotics；batch test；inhibition effect

X703.5

A

1000-6923(2017)04-1315-07

2016-08-10

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2015ZX 07202-013)

馬 靜(1992-),女,河北張家口人,北京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事厭氧氨氧化脫氮研究.

* 責(zé)任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

, 2017,37(4)：1315~1321