亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

適宜母豬配合飼料發(fā)酵的菌種篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐海燕，谷 巍*

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

本試驗(yàn)對(duì)適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌進(jìn)行了篩選，并對(duì)最適發(fā)酵菌種的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，發(fā)酵48 h時(shí)，pH最低分別達(dá)到4.12和4.25，活菌數(shù)分別達(dá)到60×108和81×108，總酸含量分別為22.56 mg/g和23.50 mg/g；適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 42 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4，活菌數(shù)最高達(dá)96×108，pH 最低為 3.92。 適宜乳酸菌 BLCC2-0092 生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度28℃，料水比5∶4和溫度32℃、料水比5∶3或5∶4，活菌數(shù)可達(dá)到109CFU/g以上。

乳酸菌；發(fā)酵飼料；活菌數(shù)；pH；總酸

微生物發(fā)酵飼料是一種利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等有益微生物對(duì)一種或多種飼料原料進(jìn)行厭氧或好氧發(fā)酵，從而提高飼料原料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)有益微生物大量繁殖、富集，功能性初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物大量生成（馬傳興等，2014；林標(biāo)生等，2013）。乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的益生菌，其是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌的總稱，通常為厭氧或者兼性厭氧菌，耐酸，在pH為4.5以下時(shí)仍可生長(zhǎng)，因此被廣泛應(yīng)用于乳制品等發(fā)酵食品中（李曉暉，2002）。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內(nèi)的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產(chǎn)性能（楊璐等，2014）；其代謝產(chǎn)物和活菌液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌都有很強(qiáng)的抑菌效果，并且pH越低，抑菌作用越強(qiáng)（王曉偉等，2015）；此外，乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料，其還具有氣味香、適口性好、飼喂便捷、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值，其在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用具有較大潛力。

本試驗(yàn)旨在研究適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌的篩選，并對(duì)篩選得到的兩株乳酸菌發(fā)酵配合飼料的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為乳酸菌發(fā)酵配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料和菌株 玉米-豆粕型配合飼料由山東泰安普瑞納飼料有限公司提供。

6 株 乳 酸 菌 菌 株 ：BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 8 g/L、酵母膏 4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸錳0.3 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 ml/L，pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將4℃條件下保存的乳酸菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 乳酸菌的篩選 稱取一定量的基料按料水比 1∶0.4 （g∶mL）配制好，裝袋（100 g/袋），每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH、活菌數(shù)和總酸含量。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化 發(fā)酵過程中菌種含量、營(yíng)養(yǎng)成分變化復(fù)雜，由于發(fā)酵過程是各菌共同作用結(jié)果，其中又主要以乳酸菌為主，因此最終選定以總菌含量和pH變化為指標(biāo)考察發(fā)酵效果（孫合美等，2014）。將篩選得到的乳酸桿菌發(fā)酵哺乳母豬配合飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，2%接種量， 發(fā)酵時(shí)間：24、48、72 h； 初始料水比：5∶2、5∶3和5∶4；發(fā)酵溫度為常溫（夜間溫度為21℃，白天溫度 21～ 23℃），28、32、37、42℃， 測(cè)定發(fā)酵料pH、乳酸菌活菌數(shù)，研究不同初始料水比和發(fā)酵溫度對(duì)飼料品質(zhì)的影響。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 樣品pH測(cè)定 取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

1.3.2 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳酸菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

1.3.3 總酸含量的測(cè)定 采用酸堿滴定法測(cè)定樣品中總酸含量。參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2008，即根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點(diǎn)，按堿液的消耗量計(jì)算樣品中的總酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響 由表1可知，除24 h時(shí)BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中以BLCC2-0015最低；48 h和72 h時(shí)，各組pH均有所下降，以BLCC2-0015和BLCC2-0092較低，BLCC2-0015在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到最低，僅為4.12。

活菌數(shù)方面：各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109水平，各取樣時(shí)間點(diǎn)均以BLCC2-0015和BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中BLCC2-0092發(fā)酵48 h活菌數(shù)達(dá)到 81×108CFU/g。

總酸含量方面：各菌株發(fā)酵料總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高，BLCC2-0015和BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組 （P＜0.05），其中以72 h-BLCC2-0015最高，為 24.84 mg/g。

綜合pH、活菌數(shù)和總酸含量，適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌優(yōu)選BLCC2-0015和BLCC2-0092。

2.2 適宜配合飼料發(fā)酵的乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 乳酸菌BLCC2-0015發(fā)酵工藝優(yōu)化 由表2可知，常溫21～23℃，料水比5∶2發(fā)酵48 h時(shí)活菌數(shù)僅在107水平；料水比5∶3發(fā)酵24h時(shí)，活菌數(shù)在108水平，到48 h及以后達(dá)到109水平；料水比5∶4時(shí)，活菌數(shù)在109水平。48 h pH和活菌數(shù)均顯著低于其他組（P＜0.05）。結(jié)合pH結(jié)果，說明常溫下乳酸菌生長(zhǎng)較慢，至少48 h以后才發(fā)酵起來。

溫度 28 ℃和 32 ℃時(shí)， 料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4時(shí)，活菌數(shù)均在109水平，幾乎均高于其他溫度同等條件下的幾十億（忽略個(gè)別計(jì)數(shù)誤差），32℃最高達(dá)到96×108CFU/g；pH呈降低趨勢(shì)，32℃時(shí)最低達(dá)到3.92，說明這兩個(gè)溫度下乳酸菌均生長(zhǎng)良好，且料水比為 5∶3 和 5∶4 時(shí)優(yōu)于 5∶2。

表1 乳酸菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

表2 乳酸菌BLCC2-0015發(fā)酵工藝優(yōu)化

溫度 37 ℃和 42 ℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4 條件下，活菌數(shù)也均在109水平，稍低于28℃和32℃時(shí)的活菌數(shù)，pH均在5及以下，說明這兩個(gè)溫度下乳酸菌均生長(zhǎng)良好。

結(jié)合計(jì)數(shù)結(jié)果及pH的結(jié)果得出，適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度28～42℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4； 其中最優(yōu)的條件為：溫度28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3或 5∶4，活菌數(shù)最高達(dá) 96×108CFU/g，pH 最低為 3.92。

2.2.2 乳酸菌BLCC2-0092發(fā)酵工藝優(yōu)化 由表3 可知，常溫 22 ～ 24 ℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4時(shí)，活菌數(shù)都在109水平，pH呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；28℃時(shí)，除個(gè)別計(jì)數(shù)誤差外，活菌數(shù)在109水平或以上，pH隨料水比升高而降低，料水比5∶4時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到或接近1010水平；32℃，料水比5∶2時(shí)，活菌數(shù)在 109水平，5∶3 和 5∶4 時(shí)均在 1010水平，pH也在同等條件下低于其他組；37℃和42℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4 條件下， 活菌數(shù)均在 109水平，pH也呈降低趨勢(shì)，到72 h時(shí)，活菌數(shù)基本低于對(duì)照組，pH也與對(duì)照組相當(dāng)，說明這兩個(gè)溫度下發(fā)酵不理想。

結(jié)合計(jì)數(shù)結(jié)果及pH的結(jié)果得出，適宜乳酸菌BLCC2-0092生料發(fā)酵的條件為：溫度28～32℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4； 其中最優(yōu)的條件為： 溫度28 ℃，料水比 5∶4 和溫度 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4，活菌數(shù)可達(dá)到109CFU/g以上。

3 結(jié)論與討論

飼料原料經(jīng)過微生物發(fā)酵后可產(chǎn)生動(dòng)物極易吸收的有益微生物菌體蛋白、酶類、生物活性小肽、氨基酸、有機(jī)酸和活性益生菌等（陸文清等，2008），形成營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料，能有效促進(jìn)動(dòng)物對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用（李維炯等，2008）。乳酸菌產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物可使腸道環(huán)境偏酸性，而一般消化酶的最適pH均偏酸性，有機(jī)酸的產(chǎn)生還可加強(qiáng)腸道的蠕動(dòng)和分泌，因此有利于各養(yǎng)分的消化吸收。

本試驗(yàn)對(duì)適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌進(jìn)行了篩選，并對(duì)最適發(fā)酵菌種發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，發(fā)酵48 h時(shí)，pH最低分別為4.12和4.25；活菌數(shù)分別達(dá)到60×108CFU/g 和 81×108CFU/g； 總酸含量分別為22.56 mg/g和23.50 mg/g。適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度28～42℃，料水比5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4， 活菌數(shù)最高達(dá) 96×108CFU/g，pH最低為3.92。適宜乳酸菌BLCC2-0092生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ℃，料水比 5∶4和溫度32℃，料水比5∶3或5∶4，活菌數(shù)可達(dá)到109CFU/g以上。

表3 乳酸菌BLCC2-0092菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

[1]李維炯，倪永珍，黃宏坤，等.微生態(tài)制劑在生態(tài)畜牧業(yè)中應(yīng)用效果[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，8：85 ～ 92.

[2]李曉暉.飼用微生物的種類和主要作用[J].飼料工業(yè)，2002，23（2）：30 ～ 32.

[3]林標(biāo)聲，黎進(jìn)，林巧雪，等.微生物發(fā)酵飼料工藝條件優(yōu)化的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（2）：162 ～ 165.

[4]陸文清，胡起源.微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應(yīng)用[J].飼料與畜牧，2008，22（7）：5 ～ 9.

[5]馬傳興，王寶維.微生物發(fā)酵飼料發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J].飼料博覽，2014，4：29～32.

[6]孫合美，汪官保，張?zhí)鹛?，?不同水分含量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵飼料pH和乳酸菌活菌數(shù)的影響[J].廣東飼料，2014，23（3）：27 ～ 28.

[7]王曉偉，高鵬飛，姚國(guó)強(qiáng)，等.乳桿菌發(fā)酵飼料的優(yōu)勢(shì)及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè)，2015，7：47 ～ 50.

[8]楊 璐，魯茗源.乳桿菌液體發(fā)酵飼料在仔豬生產(chǎn)上的應(yīng)用[J].仔豬營(yíng)養(yǎng)與飼料科技，2014，4：31 ～ 35.■

The Lactobacillus suitable for the compound feed fermentation of lactating sow was screened and the optimal fermentation strains and its fermentation conditions were optimized.The results showed that the Lactobacillus BLCC2-0015 and BLCC2-0092 were suitable for basic feed fermentation and the feed pH of 48 h-BLCC2-0015 and BLCC2-0092 reached the minimum of 4.12 and 4.25，the viable count reached 60×108and 81×108，the total acid content reached 22.56 mg/g and 23.50 mg/g.The suitable conditions for the fermentation of BLCC2-0015 were feed-water ratio of 5∶3 or 5∶4，the fermentation temperature of 28 ～ 32 ℃ for 48 h，under these conditions the viable count reached 96×108and the pH was 3.92；The suitable conditions for the fermentation of BLCC2-0092 were feed-water ratio of 5∶4，the fermentation temperature of 28 ℃ for 48 h and feed-water ratio of 5∶3 or 5∶4，the fermentation temperature of 32 ℃ for 48 h，under these conditions the viable count reached 109CFU/g.

Lactobacillus；fermentation feed；viable count of bacteria；pH；total acid content

S816.6

A

1004-3314（2017）18-0011-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171803

泰安市科技發(fā)展計(jì)劃（201540701）

*通訊作者