潘 坤 戴愛國(guó) 張澤明 趙學(xué)琴 陳 露 孟子卜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 保定 071000)

·呼吸、消化系統(tǒng)疾病·

OS-9、HIF1α在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達(dá)及臨床意義

潘 坤 戴愛國(guó)1張澤明 趙學(xué)琴 陳 露 孟子卜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 保定 071000)

目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者及非COPD患者OS-9、低氧誘導(dǎo)因子(HIF1)α表達(dá)變化情況及其臨床意義。方法應(yīng)用原位雜交法觀察OS-9 、HIF1α mRNA在氣管壁小動(dòng)脈壁的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺血管壁OS-9、HIF1α蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果COPD患者肺血管壁OS-9 mRNA及蛋白表達(dá)較非COPD組均降低(P<0.05)，COPD患者HIF1α mRNA及蛋白表達(dá)較非COPD組均升高，以蛋白升高更明顯。直線相關(guān)分析表明，OS-9蛋白與HIF1α蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.596，P<0.05)。結(jié)論OS-9或許可通過(guò)加強(qiáng)羥化酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)HIF1α的表達(dá)，作為HIF1α的負(fù)相調(diào)控因子在COPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

OS-9；低氧誘導(dǎo)因子；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患病率占40歲以上人群的8.2%〔1〕，是 低 氧 性 肺 動(dòng) 脈 高 壓的常見病因。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α在低氧條件下發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，人類很多疾病的發(fā)生都與HIF1α轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平變化有關(guān)。HIF1α在低氧大鼠及COPD患者肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔2〕。脯氨酰羥化酶(PHDs)是HIF降解的催化酶，在其降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OS-9可與HIF1α、PHDs結(jié)合，通過(guò)增強(qiáng)PHDs的酶活性促進(jìn)HIF1α的降解。本實(shí)驗(yàn)擬分析OS-9、HIF1α在COPD患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 從湖南省老年醫(yī)院、常德市第一人民醫(yī)院選取新確診肺部腫瘤的患者28例，均行肺葉切除術(shù)。所有入選病例按照要求做胸部CT和肺通氣功能檢查，根據(jù)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)(2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定)分為COPD組和非COPD組。COPD組12例，男8例，女4例；年齡(60.5±6.8)歲；肺通氣功能分級(jí)：輕度5例，中度7例。非COPD組14例，男8例，女6例；年齡(58.4±8.7)歲；兩組年齡、性別、標(biāo)本取材部位等方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2肺動(dòng)脈壁中OS-9和HIF1α mRNA的檢測(cè) 將肺組織樣本在4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中固定2 h，制成石蠟切片，用胃蛋白酶處理石蠟切片以暴露mRNA核酸片段。 在38℃濕盒中預(yù)雜交2 h后，將雜交探針加入到樣品中。 38℃濕盒雜交16 h，干環(huán)境孵育雜交2 h，沖洗并進(jìn)行封閉，將地高辛抗體加入到標(biāo)本中，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)及蘇木精染色，最后進(jìn)行脫水并封閉觀察。根據(jù)血管壁的染色程度來(lái)判斷陽(yáng)性及陰性表達(dá)結(jié)果，染色顏色越深，相對(duì)表達(dá)值越高。應(yīng)用肺動(dòng)脈壁圖像分析軟件測(cè)得肺血管壁平均吸光度，根據(jù)此定量資料比較兩組表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3OS-9和HIF1α蛋白在肺動(dòng)脈壁中的表達(dá)分析 將樣本用中性甲醛固定，按照常規(guī)程序制作石蠟切片。石蠟切片和過(guò)氧化物酶封閉溶液在室溫下孵育10 min，胰蛋白酶在37℃下孵育20 min以進(jìn)行抗原修復(fù)，之后樣品在室溫下繼續(xù)溫育5 min。最后根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明書滴加抗體，DAB、蘇木精依次染色，脫水封閉觀察血管壁。應(yīng)用肺動(dòng)脈壁圖像分析軟件測(cè)得肺血管壁平均吸光度，作為比較OS-9和HIF1α蛋白在兩組表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的定量資料。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、直線相關(guān)回歸法。

2 結(jié) 果

2.1OS-9 mRNA及蛋白質(zhì)在COPD組和非COPD組肺血管壁中的表達(dá)變化 非COPD組中，OS-9 mRNA及蛋白表達(dá)為陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，而在COPD組中OS-9 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。見表1。

2.2HIF1α mRNA及蛋白質(zhì)在COPD組和非COPD組肺血管壁中的表達(dá)變化 HIF1α mRNA的表達(dá)在非COPD組肺血管壁中為弱陽(yáng)性，同時(shí)還觀察到一部分血管壁呈陽(yáng)性，HIF1α mRNA在COPD患者中的表達(dá)呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 非COPD組血管壁HIF1α蛋白表達(dá)為陰性或弱陽(yáng)性，COPD患者血管壁表達(dá)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組OS-9、HIF1α表達(dá)比較

3 討 論

COPD是以不可逆氣流受限為特征的臨床疾病，患者一般存在呼吸衰竭并伴有低氧血癥，低氧是肺動(dòng)脈高壓形成、肺血管重構(gòu)最重要的功能性因素。HIF1α是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境最重要的一類調(diào)控因子，在肺動(dòng)脈高壓形成及肺血管重構(gòu)中也發(fā)揮著重要作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明低氧環(huán)境下COPD患者血管壁的HIF1α的翻譯、轉(zhuǎn)錄均呈上升趨勢(shì)，由此可推測(cè)出HIF1α表達(dá)增高可能與慢COPD的發(fā)病相關(guān)。

HIF1α蛋白降解有一個(gè)必要條件，即PHDs催化HIF1α氧依賴性降解區(qū)域兩個(gè)脯氨酸殘基羥基化。因此可知，可影響PHDs活性的調(diào)控因子均能間接影響HIF1α的表達(dá)。有學(xué)者體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OS-9可同時(shí)與HIF1α及PHDs結(jié)合，形成包含三者的復(fù)合物，通過(guò)增強(qiáng)PHDs的酶活性進(jìn)而促進(jìn)HIF1α的羥基化，并通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解〔4〕。在同時(shí)轉(zhuǎn)染OS-9、HIF1α、PHDs的細(xì)胞中，OS-9的表達(dá)增強(qiáng)了羥化酶的催化活性，并進(jìn)一步促使HIF1α經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解。與此相反，在OS-9被抑制表達(dá)的細(xì)胞則發(fā)現(xiàn)HIF1α表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，且其下游靶基因表達(dá)也同時(shí)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OS-9 mRNA和蛋白質(zhì)在非COPD組呈陽(yáng)性/強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，COPD組表達(dá)均降低，而HIF1α在非COPD組呈弱陽(yáng)性/陽(yáng)性表達(dá)，COPD組表達(dá)升高，分析其原因可能是由于OS-9在COPD組表達(dá)降低，相對(duì)減弱了PHDs的酶活性，因此使得HIF1α蛋白表達(dá)增高。因此，OS-9在COPD患者中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化可能影響了HIF1α的表達(dá)。OS-9或可通過(guò)影響PHDs的活性來(lái)間接調(diào)控HIF1α及其靶基因的表達(dá)，進(jìn)而作為HIF1α的一個(gè)負(fù)相調(diào)節(jié)因子影響COPD的發(fā)病過(guò)程。OS-9由Su等〔5〕于1996年最早開始研究，其基因位于人染色體12q13-15區(qū)域，在人體組織細(xì)胞廣泛表達(dá)，骨肉瘤患者中表達(dá)最明顯。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于OS-9功能的研究主要集中在其對(duì)非折疊蛋白通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑降解中發(fā)揮重要作用〔6～9〕。有關(guān)其在低氧條件下表達(dá)降低的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Sun等〔10〕通過(guò)在胰腺癌患者和體外細(xì)胞的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，OS-9 mRNA和蛋白的表達(dá)可由一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(ENST00000480739)上調(diào)表達(dá)，熒光分析實(shí)驗(yàn)提示，這一機(jī)制可能是通過(guò)激活OS-9啟動(dòng)子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。但是，低氧條件是是否由于ENST00000480739表達(dá)降低從而導(dǎo)致OS-9表達(dá)下降還需進(jìn)一步研究。

1Zhong N，Wang C，Yao W,etal.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China：a large，population-based survey〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007；176(87)：753-60.

2蔣永亮，聶 金，劉 蕾，等.ING4、PHDs以及HIF-1α在低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠中的表達(dá)變化〔J〕.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2014；23(2)：117-24.

3林 琳.老年慢性阻塞性肺疾病患者外周血HIF-1α、IL-18、Th17和Treg的表達(dá)及與肺功能的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015；35(17)：4927-9.

4Baek JH，Mahon PJ，Kelly B，etal.OS-9 interacts with hypoxia-inducible factor 1 alpha and prolyl hydroxylases to promote oxygen-dependent degradation of HIF-1 alpha〔J〕.Mol Cell，2005；17(4)：503-12.

5Su YA,Hutter MC,Trent JM,etal.Complete sequence analysis of a gene (OS-9) ubiquitously expressed in human tissues and amplified in sarcomas〔J〕.Mol Carcinog，1996；15(4)：270-5.

6Tang HY,Huang CH,Zhuang YH，etal.EDEM2 and OS-9 are required for ER-associated degradation of non-glycosylated sonic hedgehog〔J〕.PLoS One，2014；9(6)：e92164.

7Schipanski A，Oberhauser F，Neumann M，etal.Lectin OS-9 delivers mutant neuroserpin to endoplasmic reticulum associated degradation in familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies〔J〕.Neurobiol Aging，2014；35(10)：2394-403.

8Su W，Liu Y，Xia Y，etal.The Arabidopsis homolog of the mammalian OS-9 protein plays a key role in the endoplasmic reticulum-associated degradation of misfolded receptor-like kinases〔J〕.Mol Plant，2012；5(4)：929-40.

9Hosokawa N.OS-9 and XTP3-B：lectins that regulate endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD)〔J〕.Seikagaku,2011；83(1)：26-31.

10Sun YW，Chen YF，Li J，etal.A novel long non-coding RNA ENST00000480739 suppresses tumour cell invasion by regulating OS-9 and HIF-1α in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2014；111(11)：2131-41.

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

R544

A

1005-9202(2017)19-4830-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.063

1 湖南省老年醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)研究所呼吸疾病研究室

戴愛國(guó)(1966-)，男，博士后，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等及疑難病的研究。

潘 坤(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺病及哮喘研究。