張 鐸 孟 姮

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)

張 鐸 孟 姮

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

目的觀察糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4的表達(dá)。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，Morris 水迷宮試驗(yàn)篩選糖尿病腦病大鼠模型，正常對(duì)照組，糖尿病組(排除腦病)，糖尿病腦病組各隨機(jī)選取8只，進(jìn)行腦部PET/CT顯像、免疫組化法檢測(cè)腦組織IGF-1R及GLUT4表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組及糖尿病組比較，糖尿病腦病組大鼠標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)顯著降低(P<0.01)；IGF-1R表達(dá)顯著增高而GLUT4顯著下降(P<0.01)。結(jié)論糖尿病腦病大鼠腦組織IGF-1R異常高表達(dá)，擾亂了腦部糖代謝的相關(guān)通路。

糖尿病腦??；PET/CT；胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

PET/CT是根據(jù)示蹤原理，利用正電子放射核素標(biāo)記的示蹤劑來(lái)探測(cè)正常和異常組織生理和生化改變。PET/CT在癲癇、老年性癡呆、帕金森病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療決策和療效評(píng)價(jià)等方面有重要意義。本研究利用PET/CT檢測(cè)糖尿病腦病大鼠模型腦部的糖代謝水平，并利用免疫組化方法檢測(cè)糖尿病腦病大鼠海馬區(qū)胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1一般資料 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠，12周齡，體重200～250 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。購(gòu)回后飼養(yǎng)條件：室溫22℃～28℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)，飼以蛋白質(zhì)含量為21%的標(biāo)準(zhǔn)飼料塊，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w確認(rèn)健康無(wú)病后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó) Sigma 公司)，18F-FDG注射液(吉林省硅谷醫(yī)院配制)，IGF-1R單克隆抗體、GLUT4單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司),SABC免疫組化染色試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),檸檬酸，檸檬酸鈉(天津化學(xué)試劑廠),PET/CT掃描儀(美國(guó)GE公司),LifeScan 血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生),Morris水迷宮自動(dòng)監(jiān)控儀(中國(guó)科學(xué)院技術(shù)研究所)。

1.3糖尿病大鼠模型的建立 50只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)挑選10只為正常對(duì)照組，剩余40只為模型組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，禁食12 h，將 STZ 溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH=4.6)制成 0.5%的溶液，按 65 mg/kg體重腹腔單次注射。3 d后尾靜脈采血，檢測(cè)大鼠空腹血糖(FPG)值，>16.7 mmol/L 視為糖尿病模型建立成功。共成模36只，未成模者剔除。糖尿病模型成模12 w后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖尿病腦病模型是否建立成功。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由覓水，此期間模型組死亡4只，考慮為血糖過(guò)高導(dǎo)致死亡。

1.4Morris水迷宮試驗(yàn)篩選糖尿病腦病大鼠模型 成模后12 w后，PET/CT掃描前5 d開(kāi)始試驗(yàn)，前4 d為訓(xùn)練，每天上、下午各4次，每只大鼠每次訓(xùn)練2 min，將大鼠面向池壁隨機(jī)從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄從入水到找到站臺(tái)所用的時(shí)間作為測(cè)試成績(jī)(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，逃避潛伏期計(jì)為2 min，并由實(shí)驗(yàn)者將其牽引至平臺(tái)上，停留30 s后，放回籠中休息30 min之后，開(kāi)始下一次測(cè)試。第5天為測(cè)試期，記錄逃避潛伏期。逃避潛伏期同正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異者，視為糖尿病組(排除腦病)，成模21只；同正常對(duì)照組比較，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，且出現(xiàn)認(rèn)知功能減退的視為糖尿病腦病者，成模11只。正常對(duì)照組，糖尿病組，糖尿病腦病組各從中隨機(jī)選取8只，進(jìn)行PET/CT的顯像及免疫組化研究。

1.5糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 根據(jù)大鼠體重注射造影劑18F-FDG 0.75 mCi/kg，注射30 min 后進(jìn)行PET/CT顯像。顯像前采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，10 min以后，達(dá)到麻醉效果，昏睡狀態(tài)，對(duì)手術(shù)刺激無(wú)明顯反應(yīng)，麻醉后仰臥固定。先采集CT定位像，電壓80 kV，電流30 mA，球管旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.8 s，掃描層厚5 mm，重建層厚4.25 mm。隨即采集PET圖像，采集視野間的重疊數(shù)1，采集時(shí)間106 min。PET圖像經(jīng)OSEM重建，Xeleris工作站分別獲得CT、PET及兩者融合圖像，檢測(cè)大鼠腦部糖代謝情況。PET圖像均經(jīng)衰減校正處理。利用Xeleris圖像融合工作站調(diào)用PET/CT斷層圖像，獲得橫斷面數(shù)據(jù)，利用CT圖像準(zhǔn)確選取最大切面，在PET圖像上，應(yīng)用18F-FDG PET 檢測(cè)大鼠腦部葡萄糖代謝情況，利用感興趣區(qū)技術(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)。

1.6腦組織的處理及準(zhǔn)備 PET/CT顯像后，迅速剪開(kāi)胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室進(jìn)入升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心房，冰生理鹽水洗凈組織表面血液，冰盤(pán)上迅速斷頭取腦。取一側(cè)腦組織 4%多聚甲醛固定過(guò)夜，進(jìn)行免疫組化染色。

1.7免疫組化檢測(cè) 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP法)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IGF-IR及GLUT4的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，糖尿病組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿及體重下降，色暗黃，后期精神較差，行動(dòng)遲緩的癥狀。糖尿病腦病組除出現(xiàn)上述糖尿病組情況外，精神狀態(tài)更差，行動(dòng)更加遲緩。第13周時(shí)，同正常對(duì)照組比較，糖尿病組和糖尿病腦病組體重明顯降低(P<0.01)，血糖值均明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2行為學(xué)測(cè)試結(jié)果 第1天各組大鼠逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，從第2～5天各組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。同正常對(duì)照組相比，糖尿病組第4，5天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，糖尿病腦病組第2天開(kāi)始逃避潛伏期就明顯延長(zhǎng)(P<0.05,P<0.01)，與糖尿病組比較；糖尿病腦病組第4、5天逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 與正常對(duì)照組SUA(3.62±0.30)相比，糖尿病組大鼠SUV值降低趨勢(shì)極為顯著(2.11±0.25，P<0.01)；而糖尿病腦病組大鼠SUV具有同樣趨勢(shì)且更為顯著(0.31±0.03，P<0.01)；糖尿病組與糖尿病腦病模型組比較SUV值也有顯著差異(P<0.01)；說(shuō)明與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠葡萄糖代謝率明顯下降，而糖尿病腦病大鼠葡萄糖代謝率下降更為明顯。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠血糖、體重比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 各組大鼠在 Morris 水迷宮中到達(dá)平臺(tái)的平均潛伏期比較

圖1 各組大鼠PET/CT腦部糖代謝檢測(cè)

2.4免疫組化檢測(cè) 同正常對(duì)照組相比，糖尿病腦病組IGF-1R含量明顯增多，而糖尿病組IGF-1R含量少于正常對(duì)照組。見(jiàn)圖2。同正常對(duì)照組相比，糖尿病腦病組GLUT4含量明顯減少，而糖尿病組GLUT4含量明顯增多。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠腦組織IGF-1R的表達(dá)(DAB，×40)

圖3 各組GLUT4的表達(dá)(DAB，×40)

3 討 論

由于Wistar大鼠具有多樣的行為表現(xiàn)，靈敏的情緒反應(yīng)，適應(yīng)能力強(qiáng)，探索性強(qiáng)，神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)方面與人有相似性等特點(diǎn)，故被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)和記憶能力等行為學(xué)測(cè)試研究〔1，2〕。對(duì)于STZ的劑量，50～70 mg/kg體重均有使用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道并不一致〔3～5〕。本實(shí)驗(yàn)選用65 mg/kg，成模率較高。

PET/CT是目前臨床應(yīng)用最廣泛的分子影像學(xué)檢測(cè)方法之一，不僅可以清晰地顯示出軀體或器官的解剖結(jié)構(gòu)，而且還可以精細(xì)地描繪出機(jī)體分子水平上的生理病理和生物代謝過(guò)程〔6〕。PET/CT 目前在臨床上主要應(yīng)用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和心血管系統(tǒng)疾病等〔7〕。PET/CT具有極高的敏感度，在糖尿病腦病出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變之前，即可發(fā)現(xiàn)其功能性改變，確定局部腦葡萄糖代謝率及腦功能狀態(tài)異常，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和診斷糖尿病腦病具有較大的價(jià)值。

胰島素受體(IR)位于細(xì)胞膜上，為四聚體結(jié)構(gòu)，包括兩條α鏈、兩條β鏈及中間的二硫鍵。靶細(xì)胞膜上IR的α亞基與胰島素相結(jié)合，引起IR的構(gòu)象改變，α亞基對(duì)β亞基抑制去除，使β亞基上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致下游的信號(hào)蛋白被依次激活，從而促使GLUT4移位，介導(dǎo)葡萄糖由外向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝。IR在腦內(nèi)的分布非常廣泛，海馬、嗅球、下丘腦等與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能相關(guān)的大腦區(qū)域表達(dá)豐富〔8〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)胰島素/胰島素受體信號(hào)系統(tǒng)的正常運(yùn)行是維持大腦血液運(yùn)行和能量代謝正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素〔9〕，如該系統(tǒng)發(fā)生障礙，則易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙及一系列病理生理改變。

研究表明，GLUT4在腦內(nèi)亦是選擇性表達(dá)的，例如在大鼠海馬、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)區(qū)皮層、垂體后葉和下丘腦中均可見(jiàn)表達(dá)，尤其在海馬組織中表達(dá)量豐富〔10～12〕，其在腦內(nèi)的選擇性表達(dá)可能與胰島素刺激這些腦區(qū)對(duì)葡萄糖的攝取有關(guān)。葡萄糖是哺乳類(lèi)動(dòng)物大腦能量代謝的主要原料〔13〕，因其親水的特性，它不能通過(guò)脂質(zhì)雙層，但葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜是細(xì)胞產(chǎn)生能量的前提基礎(chǔ)，這一過(guò)程主要是通過(guò)GLUT4介導(dǎo)完成的〔14〕。GLUT4在腦組織能量代謝過(guò)程中的作用則顯得更為重要，其表達(dá)水平能反映腦組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求程度〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGF-1R與GLUT4在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著更為重要的作用。

1Duarte JM,Nogueira C,Mackie K,etal.Increase of cannabinoid CB1 receptor density in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Exp Neurol,2007;204(1):479-82.

2Lin YH,Westenbroek C,Tie L,etal.Effects of glucose,insulin,and supernatant from pancreatic beta-cells on brain-pancreas relative protein in rat hippocampus〔J〕.Neurochem Res,2006;31(12):1417-24.

3Chang HK,Mukes JD,Figgers CL.Ameliorative effects of dietary caloric restriction on oxidative stress and inflammation in the brain of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Am J Chin Med,2004;32(4):497-507.

4Ugochukwu NH,Bady NE.The effect of Gongronema latifolium extracts on serum lipid profile and oxidative stress in hepatocytes of diabetic rats〔J〕.J Biol Sci,2006;370(12):165-73.

5Elangovan V,Kohen R,Shohami E.Neurological recovery from closed head injury is impaired in diabetic rats〔J〕.J Neurotranma,2000;17(11):1013-27.

6Dunphy MP,Lewis JS.Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET〔J〕.J Nucl Med,2009;106S-121S.

7Vallabhajosula S.Molecular imaging:radiopharmaceuticals for PET and SPECT〔M〕.Berlin:Heidelberg,2009:201-8.

8Thomas T,Thomas G,Mclendon C,etal.β-amyloid-mediated vasoactivity and vascular endothelial damage〔J〕.Nature,1996;380:168-71.

9Dong XC,Park S,Lin XY.Irs1 and Irs2 signaling is essential for hepatic glucose homeostasis and systemic growth〔J〕.J Clin Invest,2006;1:32-6.

10Kobayashi M,Nikami H,Morimatsu M,etal.Expression and localization of insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in rat brain〔J〕.Neurosci Lett,1966;213:103-6.

11Messari SE,Leloup C,Quignon M,etal.Immunocytochemical localization of the insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in the central nervous system〔J〕.J Comp Neurol,1998;399:492-512.

12Vannucci SJ,Koehler-Stec EM,Li K,etal.Glut4 glucose transpoter expression in rodent brain effects of diabetes〔J〕.Brain Res,1998;797:1-11.

13Pardride WM.Brain metabolism:a perspective from the blood-brain barrier〔J〕.Physiol Rev,1983;63:1481-535.

14Mcewen BS,Reagen LP.Glucose transporter expression in the central nervous system:relationship to synaptic function〔J〕.Eur J Pharmacol,2004;490:13-24.

15Steen E,Terry BM,Rivera EJ,etal.Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer’s disease is this type diabetes〔J〕.J Alzheimer Dis,2005;7:63-80.

〔2016-02-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R589

A

1005-9202(2017)19-4747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.024

教育部博士基金項(xiàng)目(No.200801830071)

孟 姮(1968-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)影像學(xué)研究。

張 鐸(1970-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)影像學(xué)研究。