朱 勇 趙華棟 魏東陽 崔建嬌

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000)

辛伐他汀對COPD大鼠肺組織血紅素氧化酶-1及炎性因子表達(dá)的影響

朱 勇 趙華棟 魏東陽 崔建嬌1

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000)

目的探討辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織血紅素氧化酶(HO)-1表達(dá)的影響。方法24只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組8只。對照組：第1、15天氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.2 ml，其余時(shí)間正常喂養(yǎng)；煙霧暴露組：第1、15天氣管內(nèi)滴入脂多糖0.2 ml，將8只大鼠放進(jìn)大鼠吸煙裝置染毒箱內(nèi)COPD建模；辛伐他汀組：建立COPD模型方法同上，每次熏煙結(jié)束后，給予辛伐他汀灌胃治療(5 mg/kg)，置于相同的環(huán)境中喂養(yǎng)。右心導(dǎo)管測定大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)，以右心室肥厚指數(shù)(RVHI)作為評價(jià)右心室肥厚的指標(biāo)。蘇木精-伊紅(HE)染色檢測大鼠肺組織病理學(xué)變化。實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法測定肺組織HO-1 mRNA的表達(dá)，通過Western印跡及免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織HO-1蛋白的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平。結(jié)果辛伐他汀組mPAP較煙霧暴露組下降，煙霧暴露組較對照組升高(P<0.05)。辛伐他汀組RVHI較煙霧暴露組下降(P<0.05)。辛伐他汀組鏡下觀察氣管壁增厚，管腔變窄且肺動(dòng)脈壁增厚，但是較煙霧暴露組減輕。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛伐他汀組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒最多。辛伐他汀組HO-1 mRNA是對照組的(7.26±2.11)倍。煙霧暴露組大鼠HO-1表達(dá)增強(qiáng)，辛伐他汀治療后表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。在BALF中，IL-6和TNF-α在辛伐他汀組、煙霧暴露組較對照組表達(dá)增加(P<0.05)。辛伐他汀組、煙霧暴露組均較對照組血清IL-6表達(dá)增加(P<0.05)，TNF-α 在辛伐他汀組、煙霧暴露組較對照組表達(dá)增加(P<0.05)，辛伐他汀組中TNF-α表達(dá)量較煙霧暴露組降低(P<0.05)。結(jié)論辛伐他汀能夠促進(jìn)COPD表達(dá)HO-1，減輕COPD炎癥反應(yīng)，改善COPD的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。

慢性阻塞性肺疾??；吸煙；血紅素氧合酶-1；辛伐他汀

血紅素氧化酶(HO)-1具有抗感染、抗氧化損傷等生理功能〔1〕，是一種保護(hù)性和適應(yīng)傷害性刺激反應(yīng)，常表達(dá)于肺、心等器官組織〔2〕，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平〔3〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有高致殘率和病死率，降脂類藥物辛伐他汀能夠減少心血管疾病的病死率和發(fā)病率〔4〕，但對呼吸系統(tǒng)的影響尚無定論。HO-1是誘導(dǎo)酶，可受多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，在肺內(nèi)被應(yīng)激因素刺激后表達(dá)。本研究通過煙熏法復(fù)制COPD模型，觀察辛伐他汀對COPD大鼠肺功能的影響及HO-1在COPD中發(fā)揮的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 辛伐他汀(常州九天醫(yī)藥公司，生產(chǎn)批號(hào)：20070901)；哈德門牌香煙(山東中煙工業(yè)公司，標(biāo)示：焦油含量13 mg，煙堿量為1.2 mg，煙氣一氧化碳量為15 mg)；HO-1免疫組化測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，中國)；大鼠吸煙裝置(JY-01型)(石家莊綿陽科技開發(fā)有限公司，中國)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒96T，大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒96T(南京建成賽浩科技有限公司，中國)。健康雄性SD大鼠24只(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)1501003)，體重(100±9)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級飼養(yǎng)，飼料和水嚴(yán)格滅菌。

1.2方法

1.2.1分組與模型制作 大鼠經(jīng)1 w適應(yīng)喂養(yǎng)后，24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組8只。對照組：第1、15天氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.2 ml，其余時(shí)間正常喂養(yǎng)；煙霧暴露組：第1、15天氣管內(nèi)滴入脂多糖0.2 ml，將8只大鼠放進(jìn)大鼠吸煙裝置染毒箱內(nèi)，箱上端有兩個(gè)(1.5 cm×1.5 cm)小孔與外界相通，防止動(dòng)物缺氧，香煙去掉過濾嘴后插入染毒箱中點(diǎn)燃，關(guān)閉染毒箱，1 h后取出大鼠，休息12 h后再重復(fù)以上操作1次，連續(xù)熏煙5 w，每次熏煙結(jié)束后，將煙霧暴露組置于和對照組相同的環(huán)境中喂養(yǎng)飼料。辛伐他汀組：建立煙霧暴露組COPD模型方法同上，每次熏煙結(jié)束后，給予辛伐他汀灌胃治療(5 mg/kg)，置于相同的環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2.2平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心室肥厚指數(shù)測定(RVHI)與血清、支氣管肺泡灌洗液采集 實(shí)驗(yàn)第5周，熏煙結(jié)束后，首先將各組大鼠用天平稱重，然后利用腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，后仰臥位固定，分離腹主動(dòng)脈，抽取動(dòng)脈血3 ml，于2 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存。將0.9 mm的聚苯乙烯管進(jìn)入右心房、右心室(RV)、肺動(dòng)脈，利用壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀測定mPAP。mPAP測定結(jié)束后，通過股動(dòng)脈緩慢放血處死大鼠，開胸暴露肺和心臟，對大鼠肺部結(jié)扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，然后用2 ml生理鹽水進(jìn)行灌洗3次，回收率約為80%，支氣管肺泡灌洗液(BALF)4℃ 1 000 r/min 離心10 min，上清液-20℃保存，沉淀用0.5 ml生理鹽水混勻后編號(hào)待檢。進(jìn)行瘀血清理和沖洗后，完整的取下大鼠心臟，沿室間隔分離RV、左心室加室間隔(LV+S)，分別稱重，以RV/(LV+S)的質(zhì)量比(RVHI)作為評價(jià)右心室肥厚的指標(biāo)。利用生理鹽水進(jìn)行肺血管沖洗，以無菌棉簽分出各個(gè)肺葉，肺葉用生理鹽水沖洗后放入冷凍管置于液氮中儲(chǔ)存處理及另一個(gè)肺葉放入裝有甲醛的廣口瓶中。

1.2.3大鼠肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色 10%中性甲醛固定大鼠肺組織72 h，脫水、石蠟包埋連續(xù)切片，脫蠟至水，蒸餾水浸泡后，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分色浸泡，伊紅溶液染色，乙醇脫色，二甲苯透明。應(yīng)用中性樹膠封片，置于玻片架上自然烘干，置于顯微鏡圖像處理系統(tǒng)(中國醫(yī)科大學(xué)BHEC)下觀察，應(yīng)用顯微鏡(日本Olympus)采集圖片。

1.2.4采用免疫組化方法檢測大鼠肺組織中HO-1蛋白的表達(dá) 多聚-L-賴氨酸溶液內(nèi)浸泡處理載玻片，干后存放于干燥避光的條件下備用。取固定48 h的肺葉，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，經(jīng)過脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3% H2O237℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中煮沸(95℃，15 min)，自然冷卻20 min以上，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min。滴加山羊血清后于37℃恒溫箱中放置40 min。滴加一抗(兔抗人lgG，北京達(dá)科為生物科技有限公司)，置于4℃冰箱中過夜。加入生物素化二抗，置于37℃恒溫箱中30 min。DAB溶液滴加顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明，并用中性樹膠封片。以上洗片用PBS緩沖液中浸洗5 min/次，共3次。顯微鏡下觀測。判斷標(biāo)準(zhǔn)：參與表達(dá)的平滑肌細(xì)胞胞膜上呈現(xiàn)出棕黃色顆粒，表達(dá)和顏色呈正比；而平滑肌細(xì)胞膜上無棕黃色顆粒出現(xiàn)，則說明表達(dá)為陰性。

1.2.5HO-1 mRNA在大鼠肺組織中的表達(dá) 利用消毒的陶瓷研磨器加液氮研磨取大鼠肺組織100 mg，粉末狀后收集到滅菌的EP管中，向其中加入1 ml Trizol裂解液。按照Trizol試劑說明書提取組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,進(jìn)行熒光定量 PCR。HO-1 mRNA引物序列：HO-1上游引物：5′-TGT CCC AGG ATT TGT CCG AG-3′，下游引物： 5′-ACT GGG TTC TGC TTG TTT CGC T-3′，產(chǎn)物長度：118 bp；β-actin上游引物：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′,下游引物：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，產(chǎn)物長度：153 bp。采用Trizol一步抽提法提取總RNA，20 μl體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，25 μl體系中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃ 5 s,60℃退火20 s,72℃延伸60 s。HO-1和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。取23 μl的反應(yīng)體系和相對應(yīng)的cDNA，按順序放入到熒光定量PCR檢測分析儀(ABI 7700，美國)中，進(jìn)行熒光定量分析。以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算HO-1 mRNA的表達(dá)量，以2-△△CT表示。實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行孔。

1.2.6Western印跡檢測大鼠肺組織HO-1的表達(dá) 取出液氮中保存的大鼠肺組織，4℃解凍后組織勻漿；按勻漿后組織體積∶裂解液的比例為1∶5加入裂解液，加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑；按照二喹啉甲醛(BCA)試劑盒說明書求測定蛋白液濃度，以總蛋白質(zhì)量為50 μg計(jì)算所需蛋白樣本體積及10 μl上樣體系中待補(bǔ)充的PBS和5倍蛋白上樣緩沖液，配置好的蛋白上樣體系在100℃下加熱5 min；通過十二烷基硫酸鈉-聚兩烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，分離膠10%、濃縮膠5%)分離蛋白，分離膠電壓80 V，濃縮膠120 V；轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙衡(PVDF)膜(millipore公司)，電壓100 V 60 min；用Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗膜3次×10 min，然后加入封閉液(含5%胎牛血清的TBST液)中，37℃封閉60 min；加一抗，兔抗鼠多克隆HO-1(1∶100)，4℃搖晃過夜。次日TBST洗膜3次×10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育90 min。取出膜后，TBST洗膜3次×10 min，ECL plus化學(xué)發(fā)光顯色(賽默飛，美國)，天能發(fā)光系統(tǒng)TIF保存文件，Image-J圖像軟件系統(tǒng)分析。內(nèi)參選用β-actin。

1.2.7檢測BALF和血清IL-6、TNF-α水平及BALF中的白細(xì)胞數(shù) 本實(shí)驗(yàn)采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒96T，大鼠IL-6 ELISA試劑盒96T測定血清、BALF中 IL-6、TNF-α水平，提前40 min將試劑盒從4℃冰箱中取出，置于室溫下(約14℃)，血清、BALF標(biāo)本從-20℃冰箱中取出室溫下融化。各步驟嚴(yán)格按照試劑使用說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)(Thermo Scientific，美國)。取與生理鹽水混勻后的BALF沉淀，置于血球計(jì)數(shù)儀(Thermo Scientific，美國)計(jì)數(shù)BALF中白細(xì)胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠基本指標(biāo)比較 在煙霧暴露實(shí)驗(yàn)前三組〔對照組(108.0±9.0)g，煙霧暴露組(108.0±8.0)g，辛伐他汀組(113.0±6.0)g〕大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；煙霧暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，辛伐他汀組大鼠體重〔(447.0±15.0)g〕低于對照組〔(491.0±11.0)g，P<0.05〕，煙霧暴露組〔(447.0±15.0)g〕也低于對照組(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠mPAP〔(22.24±0.80)mmHg〕高于對照組〔(15.21±1.00)mmHg，P<0.05〕，煙霧暴露組〔(29.44±1.00)mmHg〕也高于對照組(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠RVHI(0.24±0.04)高于對照組(0.22±0.04)(P<0.05)，煙霧暴露組(0.29±0.05)也高于對照組(P<0.05)。

2.23組大鼠肺組織HE染色 對照組肺泡及氣管壁輪廓清晰，肺動(dòng)脈壁未見增厚。煙霧暴露組肺泡擴(kuò)張，炎癥浸潤，血管壁增厚，氣管壁較對照組增厚，管腔變窄，并且肺動(dòng)脈壁增厚。辛伐他汀組血管狹窄減輕，肺泡擴(kuò)張降低，氣管壁增厚，管腔變窄，并且肺動(dòng)脈壁增厚，但是較煙霧暴露組減輕。見圖1。

圖1 3組大鼠肺組織的病理變化(HE，×400)

2.33組大鼠肺組織中HO-1的表達(dá) 辛伐他汀組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒最多，煙霧暴露組比對照組多。見圖2。

2.43組大鼠肺組織中HO-1 mRNA表達(dá) 辛伐他汀組HO-1 mRNA(7.26±2.11)高于煙霧暴露組(2.02±1.66，P<0.05)，煙霧暴露組表達(dá)高于對照組(1.00±0.00，P<0.05)。

2.5Western印跡檢測大鼠肺組織中的HO-1 煙霧暴露組大鼠肺組織中HO-1蛋白表達(dá)較對照組增加，辛伐他汀治療后表達(dá)明顯增加。見圖3。

圖2 3組大鼠肺組織中HO-1的表達(dá)(IHC，×400)

圖3 Western印跡檢測HO-1在COPD大鼠肺組織的表達(dá)

2.6BALF和血清中IL-6、TNF-α水平及BALF中的白細(xì)胞數(shù) 在BALF中，辛伐他汀組、煙霧暴露組IL-6和TNF-α水平較對照組表達(dá)增加(P<0.05)。辛伐他汀組、煙霧暴露組血清中IL-6、TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)，辛伐他汀組TNF-α表達(dá)量低于煙霧暴露組(P<0.05)。辛伐他汀組BALF中白細(xì)胞數(shù)為(0.86±0.23)×109/L，與對照組〔(0.65±0.38)×109/L〕比較差異顯著(P<0.05)，煙霧暴露組〔(3.03±1.38)×109/L〕較對照組明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 BALF和血清中IL-6、TNF-α的水平

3 討 論

COPD主要由遺傳因素、氣道高反應(yīng)等個(gè)體易感因素和吸煙、空氣污染等環(huán)境因素導(dǎo)致，其中吸煙為最主要的環(huán)境致病因素〔4〕。目前COPD常規(guī)治療中激素類藥物的使用可以緩解患者慢性炎癥反應(yīng)，但是全身性激素應(yīng)用的嚴(yán)重副作用及吸入性激素使用的局限性導(dǎo)致其治療效果有限〔5〕。研究顯示，他汀類藥物在除調(diào)脂作用外，還有抗氧化和抗感染等功效〔6〕。

本研究結(jié)果顯示煙霧暴露組mPAP、RVHI明顯高于對照組，肺動(dòng)脈壁增厚，應(yīng)用辛伐他汀組的mPAP、RVHI明顯下降，肺動(dòng)脈壁增厚減輕，這是由于他汀類藥物是通過抑制異戊二烯類的合成，增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶合成，減少其滅活。研究顯示，適量的HO-1在COPD中發(fā)揮保護(hù)作用〔7〕，其在發(fā)熱、應(yīng)激等狀態(tài)刺激下，使內(nèi)源性一氧化碳產(chǎn)量升高，提高了機(jī)體的應(yīng)激能力。本研究發(fā)現(xiàn)，從煙霧暴露組開始，辛伐他汀組的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞膜上出現(xiàn)的棕黃色顆粒增加最為明顯，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀組HO-1的表達(dá)多于煙霧暴露組。HO-1 mRNA在煙霧暴露組較對照組表達(dá)增高，而辛伐他汀組HO-1 mRNA更高。推測可能是因?yàn)樵跓熿F暴露組COPD模型中，經(jīng)過煙霧及脂多糖等外界因素的刺激，發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，出于機(jī)體自身的免疫機(jī)制，HO-1開始增多，最后產(chǎn)生適應(yīng)性和保護(hù)性的反應(yīng)，在辛伐他汀組，HO-1升高更加明顯，可能是因?yàn)镠O-1途徑是辛伐他汀產(chǎn)生作用的關(guān)鍵通道，發(fā)揮自身抗炎癥、抗增殖等作用，從而對COPD產(chǎn)生治療作用〔8〕。

COPD的主要發(fā)病機(jī)制之一是肺及全身慢性炎癥反應(yīng)，本研究推測辛伐他汀對于COPD還具有抗感染作用，能夠減輕COPD大鼠全身炎癥反應(yīng)。TNF-α具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及炎癥誘導(dǎo)作用。IL-6主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，具有多種活性的炎癥細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)的功能，但在病理狀態(tài)下，其水平的增高可以引起一系列的病理損傷。本研究結(jié)果說明起到了有效地抗感染作用。Loukides等〔9〕研究表明，降低全身炎癥程度能改善COPD自然進(jìn)程及預(yù)后，同本研究結(jié)果一致。

1穆 珺,莊曉明.血清血紅素氧化酶-1水平與糖調(diào)節(jié)受損及其動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究〔J〕.中國糖尿病雜志,2015;23(10):881-4.

2Lee SE,Yang H,Son GW,etal.Crotonaldehyde-exposed macrophages induce heme oxygenase-1 expression as an adaptive mechanism〔J〕.Mol Cell Toxicol,2015;11(2):167-74.

3Lim HS,Jin S,Yun SJ,etal.Modulation of melanogenesis by heme oxygenase-1 via p53 in normal human melanocytes〔J〕.Chonnam Med J,2016;52(1):45-52.

4陳婉華,周偉成,黃錦倫,等.辛伐他汀聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療COPD穩(wěn)定期合并代謝綜合征患者的臨床研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016;16(23):4508-11.

5Matera MG,Cardaci V,Cazzola M,etal.Safety of inhaled corticosteroids for treating chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Exp Opin Drug Saf,2015;14(4):533-41.

6Keskiv?li T,Kujala P,Visakorpi T,etal.Statin use and risk of disease recurrence and death after radical prostatectomy〔J〕.Prostate,2016;76(5):469-78.

7徐 冰,張一兵.慢性阻塞性肺病大鼠血紅素加氧酶-1表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(9):2353-5.

8Zhao W,Song H,Huo W.Long-term administration of simvastatin reduces ventilator-induced lung injury and upregulates heme oxygenase 1 expression in a rat model〔J〕.J Surg Res,2015;199(2):601-7.

9Loukides S,Bartziokas K,Vestbo J,etal.Novel anti-inflammatory agents in COPD:targeting lung and systemic inflammation〔J〕.Curr Drug Targets,2013;14(2):235-45.

〔2017-03-26修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R692

A

1005-9202(2017)19-4742-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.022

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015020355)

1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心

崔建嬌(1972-)，女，碩士，副主任檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

朱 勇(1971-)，男，碩士生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。