林冬靜 徐 冶 田洪燕 趙麗微 李 強 盧曉晶 陳 為

(吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

大鼠肝癌發(fā)展過程MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的動態(tài)變化

林冬靜 徐 冶1田洪燕 趙麗微2李 強3盧曉晶4陳 為5

(吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的研究p38、JNK、ERK表達與肝癌發(fā)生的關(guān)系。方法雄性Wistar大鼠隨機分為空白對照組和模型組，空白對照組自由飲用食用水；模型組采用間斷性自由飲用二乙基亞硝胺(DEN)食用水的方法誘發(fā)肝癌模型，第0、5、9、12、14、16、18、20周取出肝臟，觀察其病理學(xué)改變；檢測p38、JNK及ERK1/2 mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果模型組大鼠肝變硬，出現(xiàn)巨塊狀結(jié)節(jié)，癌細胞強嗜堿性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹，嵴斷裂，核染色質(zhì)邊緣化；與空白對照組比較，模型組p38 mRNA表達水平9、12 w增加(P<0.05)，JNK mRNA表達水平從5 w增加至16 w，隨后表達水平顯著降低(P<0.05)，ERK mRNA表達水平18 w顯著降低(P<0.05)；模型組p-p38蛋白14、16、20 w表達均明顯降低(P<0.05)，p-JNK蛋白5 w、12～20 w表達明顯升高(P<0.05)，p-ERK1/2蛋白5 w表達明顯增加，18 w表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論DEN誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生中，MAPK信號中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體關(guān)系密切。

肝細胞肝癌；二乙基亞硝胺；MAPK；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

原發(fā)性肝細胞肝癌(HCC)已成為發(fā)生率上升最快的惡性腫瘤，這與慢性病毒性肝炎和長期過量飲酒導(dǎo)致肝硬化關(guān)系密切〔1,2〕。在大多數(shù)已經(jīng)形成的腫瘤組織中或者經(jīng)體外實驗探討其成因，發(fā)現(xiàn)絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究采用二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型，模擬人肝細胞癌發(fā)生，動態(tài)觀察該通路不同時相p38、JNK、ERK1/2蛋白表達情況，分析其所代表的三條通路與肝癌發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級雄性Wistar大鼠136只，5周齡，體質(zhì)量140～160 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(吉)2013- 0001。

1.2主要試劑和抗體 Trizol試劑為美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均購自中國碧云天公司。p38、JNK、ERK和GAPDH引物由上海生工合成。p38多克隆抗體和p-p38單克隆抗體分別購自中國凱基生物科技發(fā)展有限公司和美國Santa cruz公司，JNK抗體購自美國Abcam公司，p-JNK抗體購自美國Santa cruz公司，ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體購自中國沈陽萬類生物。HRP標(biāo)記羊抗兔二抗和β-actin抗體購自中國天津三箭公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器 550型酶標(biāo)儀和Western電泳槽均為美國Bio-Rad開發(fā)公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)膜儀為Tianon公司產(chǎn)品，電泳儀為中國六一儀器廠產(chǎn)品，中國Genesys凝膠成像分析系統(tǒng)采集蛋白表達圖像并進行密度分析，D-78532型臺式低溫超速離心機為日本Hettich公司；JEM-1200EX型透射電鏡為日本Hitachi公司產(chǎn)品；凝膠圖像分析儀為中國國瑞實驗儀器公司產(chǎn)品。

1.4大鼠肝癌模型的建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機分為：①空白對照組(0 w)16 只：飲用滅菌食用水；②模型組120 只：自由飲用滅菌食用水配置0.01%DEN(美國Sigma公司，其純度為99.9%)溶液，隔天更換1次，連續(xù)5 w 后，改飲滅菌食用水3 w，再繼續(xù)飲用含0.01%DEN溶液12 w 停藥。造模過程觀察各組大鼠精神狀態(tài)、體重變化。

1.5取材 誘癌開始后第0、5、9、12、14、16、18、20周分批處死大鼠，空白對照組2只，模型組3只。取出肝臟，觀察肝臟外觀(大小、色澤、質(zhì)地、有無結(jié)節(jié)形成等)，取新鮮肝組織迅速用0.9%生理鹽水漂洗，未出現(xiàn)癌灶者取部分肝組織，出現(xiàn)癌灶者取肉眼癌灶及距癌灶邊緣1 cm 癌旁組織，均用10%中性甲醛固定，制備石蠟切片；另取一部分組織置于戊二醛和鋨酸中雙重固定，透射電鏡觀察肝細胞的超微結(jié)構(gòu)；部分組織于-80℃保存。

1.6HE染色 石蠟切片，經(jīng)脫蠟、脫水、漂洗、蘇木精染色、分化、漂洗、伊紅染色、再脫水、透明、封片。光鏡下觀察，照相。

1.7RT-PCR技術(shù)檢測基因mRNA表達 按TRIzol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，檢測總RNA濃度，取RNA樣品，按RT-PCR試劑盒說明書操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察圖像并拍照。目的基因的mRNA相對含量=目的基因密度/GAPDH密度。

1.8Western印跡技術(shù)檢測蛋白表達 取相同質(zhì)量的肝組織加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上快速組織超聲破碎，12 000 r/min離心15 min取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。等量等體積的總蛋白經(jīng)12%分離膠和4%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用5%脫脂奶粉搖床緩慢封閉約1.5 h后分別加入適當(dāng)稀釋比例的ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK抗體，4 ℃過夜，第2天加入二抗孵育1 h，PBST漂洗，ECL顯影。采用Genesys凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像并用圖像分析軟件對所得條帶進行相對定量分析。目的蛋白表達的相對含量=目的蛋白表達密度/β-actin表達密度。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行t檢驗、方差分析，q檢驗，秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1DEN對大鼠一般狀態(tài)的影響 空白對照組大鼠未出現(xiàn)死亡，精神狀態(tài)良好，體重增加。模型組大鼠在造模3 w時死亡1只，隨著飲用DEN溶液時間延長，大鼠出現(xiàn)嗜睡，精神萎靡，毛色暗，粗糙，不整齊，伴有不潔；9 w后體重有所降低，14 w進食量、進水量均明顯減少，尿液發(fā)黃，糞便量減少，體重繼續(xù)下降；18 w時大鼠多聚集蜷曲，很少活動，1例死亡，解剖后見明顯肝癌結(jié)節(jié)，20 w時，懶動體輕，對一般的物理刺激反應(yīng)極差。

2.2DEN對大鼠肝臟大體形態(tài)和病理學(xué)改變的影響 見圖1～圖3。肉眼見空白對照組大鼠肝臟呈現(xiàn)淡紅色，具有光澤度，質(zhì)地柔軟而富有彈性，表面光滑，邊緣整齊，5、9 w模型組大鼠肝臟顏色略暗，顏色加深，表面光澤度較空白對照組差，12 w時肝表面出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，大小不一，數(shù)量不等，散在分布，肝組織邊緣鈍化，體積略有下降，20 w肝組織變硬，色淺，表面出現(xiàn)巨塊狀結(jié)節(jié)，彌漫分布。光鏡下可見：空白對照組0 w 大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊，核清晰，大小一致且分布均勻，肝細胞索圍繞中央靜脈，呈放射狀分布，肝竇清晰；模型組大鼠：5 w肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，9 w 部分肝細胞呈氣球樣變，小葉內(nèi)可見灶性壞死伴炎性細胞浸潤，同時逐漸出現(xiàn)纖維組織增生及肝細胞再生；12～16 w 肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)纖維組織間隔，形成典型的假小葉結(jié)構(gòu)；18～20 w 癌變期的癌細胞異型性明顯，胞核增大，胞質(zhì)少，嗜堿性增加，可見較多的單核細胞和核分裂相，部分可見癌細胞浸潤周圍組織，侵犯血管，并有灶內(nèi)出血、壞死現(xiàn)象。超微結(jié)構(gòu)：空白對照組0 w 大鼠的肝肝細胞內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糖原都較為豐富，可見溶酶體，線粒體雙層膜和嵴，各時間段的模型組肝細胞的線粒體、高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體雙層膜等均隨著給藥時間的增加而出現(xiàn)不同程度的細胞器結(jié)構(gòu)破壞，20 w 時可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹，嵴斷裂，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞，部分線粒體形成電子透亮區(qū)，核染色質(zhì)邊緣化，部分細胞器外側(cè)可見雙側(cè)膜包裹，形成自噬體。

2.3DEN對MAPK通路分子mRNA表達水平的影響 飲用DEN食用水溶液，p38 mRNA表達水平從9 w開始明顯升高，直至12 w，在18 w表達水平下降(P<0.05)；JNK RNA表達水平5 w、12 w 增加，14～18 w表達水平降低(P<0.05)。ERK1/2 mRNA表達12 w增加，18 w表達降低(P<0.05)，表明DEN誘發(fā)腫瘤發(fā)生中p38、JNK、ERK基因mRNA表達均有改變，并且三者間的這種改變不同步，見表1，圖4。

2.4DEN對MAPK通路分子蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，0～9 w p-p38蛋白表達升高，至14、16、20 w 降低，18 w時表達升高(P<0.05)；p-JNK蛋白在5～20 w時表達明顯升高(P<0.05)；JNK總蛋白表達水平無顯著改變(P>0.05)；p-ERK1/2蛋白表達水平5 w升高，18 w 降低(P<0.05)，提示DEN誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生過程p38和JNK、ERK1/2蛋白發(fā)生動態(tài)改變，主要在磷酸化水平發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。見圖5，表2。

圖1 各組肝臟大體形態(tài)變化

圖2 各組肝組織病理學(xué)改變(HE，× 200)

圖3 各組肝細胞超微結(jié)構(gòu)(×6 500)

組別p38JNKERK1/2空白對照組1±0.531±0.491±0.51模型組5w1.49±0.612.05±0.741)0.85±0.0891)模型組9w2.32±0.831)2.65±0.751)1.08±0.21模型組12w2.88±0.91)6.02±1.321)1.40±0.261)模型組14w1.41±0.442.26±0.681)0.94±0.082模型組16w0.75±0.092.54±0.661)1.03±0.19模型組18w1.54±0.641)0.43±0.0761)0.29±0.071)模型組20w1.96±0.581)1.64±0.520

與空白對照組比較：1)P<0.05，下表同

1～8:空白對照組、模型組5、9、12、14、16、18、20 w，下圖同圖4 各組肝組織p38、JNK、ERK1/2 mRNA表達

圖5 各組p38、JNK、ERK1/2磷酸化蛋白表達水平

組別p-p38/p38pJNK/JNKpERK1/ERK1pERK2/ERK2空白對照組1.12±0.511.18±0.461.23±0.380.98±0.25模型組5w1.76±1.051.53±0.361)1.41±0.261)1.35±0.891)模型組9w2.46±1.291.12±0.401.03±0.170.78±0.26模型組12w1.98±0.871.47±0.411)0.95±0.230.48±0.171)模型組14w1.63±0.981)1.34±0.281)0.54±0.461)0.75±0.34模型組16w0.91±1.421)1.59±0.321)0.83±0.080.56±0.0781)模型組18w10.77±4.861)1.45±0.351)0.38±0.0221)0.35±0.0191)模型組20w0.76±0.041)1.45±0.291)1.21±0.530.61±0.23

3 討 論

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK是HCC發(fā)展關(guān)鍵通路之一，MAPK信號主要有ERK、JNK、p38-MAPK三條途徑，當(dāng)它們受到EGF、VEGF、PDGF、HGF等生長因子刺激，各個信號分子殘余的酪氨酸被磷酸化，活化，進而發(fā)揮生物調(diào)節(jié)功能〔3～7〕。

肝癌動物模型多采用DEN作為誘癌劑〔8〕。DEN是一種DNA羥化物，具有中毒性和致癌性雙重效應(yīng)，有很高的致癌率，特別對于肝臟，最終形成肝硬化伴發(fā)HLL。有研究表明DEN誘發(fā)HCC時，第1～4周為肝炎、肝纖維化期，為中毒性肝炎表現(xiàn)；第5～12周為肝硬變期；第14～18周為癌變期，這與預(yù)后較差的人類HCC特點較為相似〔9〕。本研究顯示DEN誘發(fā)大鼠HCC發(fā)生中，MAPK信號中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體關(guān)系密切。本研究采用大鼠間斷性自由飲用DEN食用水給藥途徑，模擬人原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生，這樣極大減少其他給藥途徑對大鼠的應(yīng)激反應(yīng)，利于后續(xù)實驗觀察和檢測。同時結(jié)合原發(fā)性肝細胞肝癌形成的關(guān)鍵時期(肝炎、肝纖維形成，中毒性肝炎、肝硬變、癌變)進行肝腫瘤組織的定點取材，動態(tài)觀察MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各種調(diào)控因子的變化，補充在已經(jīng)形成的腫瘤組織中或者是在體外細胞株中得到的結(jié)果，為后續(xù)開展體外實驗MAPK調(diào)控腫瘤細胞生物學(xué)特征機制時提供依據(jù)。

1Schütte K,Bornschein J,Malfertheiner P.Hepatocellular carcinoma-epidemiological trends and risk factors〔J〕.Dig Dis,2009;27(2):80-92.

2Hernandez-Gea V,Toffanin S,Friedman SL,etal.Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2013;144(3):512-27.

3El-Serag HB,Kanwal F,Davila JA,etal.A new laboratory based algorithm to predict development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C and cirrhosis〔J〕.Gastroenterology,2014;146(5):1249-55.

4El-Serag HB,Alsarraj A,Richardson P,etal.Hepatocellular carcinoma screening practices in the department of veterans affairs:findings from a national facility survey〔J〕.Dig Dis Sci,2013;58(11):3117-26.

5毛 華,黃純熾,趙敏芳.p38MAPK信號傳導(dǎo)通路調(diào)控VEGF誘導(dǎo)肝癌細胞黏附作用〔J〕.世界華人消化雜志,2006;14(8):778-83.

6周 曙,蔡 濤,覃興貴,等.JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在黃芩苷誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡中的作用〔J〕.解放軍醫(yī)藥雜志,2015;27(4):20-2.

7戴紅良,賈桂枝,趙 艷,等.染料木黃酮通過抑制EGFR/ERK通路抗肝癌SMMC7721細胞增殖〔J〕.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015;36(1):1-3.

8程延安,袁利超,黨雙鎖,等.間斷小劑量DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型研究〔J〕.腫瘤防治雜志,2005;12(11):806-8.

9張志敏,王 閣,陳 川,等.改進性DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立與病理形態(tài)學(xué)研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007;29(12):1164-7.

〔2016-07-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R735.7

A

1005-9202(2017)19-4739-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.021

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(No.2013-357)

1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 病理學(xué)教研室 3 免疫學(xué)教研室 4 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 5 檢驗學(xué)院

林冬靜(1977-)，女，講師，在讀博士，主要從事腫瘤病理生物學(xué)研究。