楊 洋 徐 婭 劉楊安 鮑 媛 杜鴻麗 楊 名

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院網(wǎng)絡(luò)醫(yī)療部，湖北 武漢 430014)

FABP3基因?qū)π募〖?xì)胞凋亡的影響

楊 洋 徐 婭 劉楊安 鮑 媛 杜鴻麗 楊 名

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院網(wǎng)絡(luò)醫(yī)療部，湖北 武漢 430014)

目的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)3基因?qū)π募〖?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法將H9C2心肌細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、FABP3沉默組、FABP3沉默+空質(zhì)粒組及FABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組，轉(zhuǎn)染72 h后Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中FABP3的蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western印跡檢測(cè)Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組及FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組之間FABP3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)ABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組FABP3的蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組FABP3的蛋白表達(dá)顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)；FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組FABP3(P<0.01)；沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著低于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)。結(jié)論沉默F(xiàn)ABP3的表達(dá)可促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

FABP3；心肌細(xì)胞；凋亡

心肌細(xì)胞凋亡可參與心力衰竭、冠心病、心肌炎、心絞痛及心臟自身免疫性疾病等多種心血管疾病的發(fā)生過(guò)程，但引起心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究的尚不清楚〔1〕。脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)3又稱為心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白，為一種非分泌的可溶性蛋白，其可參與線粒體能量代謝，在心肌細(xì)胞能量產(chǎn)生過(guò)程中可將胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，其過(guò)表達(dá)可顯著抑制心肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔2,3〕。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ABP3可作為檢測(cè)早期心肌損傷的生物標(biāo)志物〔4〕。但FABP3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制研究的尚不清楚。本研究通過(guò)沉默和過(guò)表達(dá)FABP3，檢測(cè)其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 H9C2細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；FABP3 siRNA及陰性慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；目的質(zhì)粒pCXN2-Flag-hFABP3及空質(zhì)粒pCXN2--Flag由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；FABP3、Cleaved caspase3、Bcl-2單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)abcam公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；BCA試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；PAGE凝膠電泳儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 H9C2心肌細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以1×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%以上時(shí)更換新的培養(yǎng)基。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及FABP3沉默組，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換為新鮮的培養(yǎng)基，在陰性對(duì)照組及FABP3沉默組中加入工作濃度為1.5 μg/ml的嘌呤霉素，空白對(duì)照組不加嘌呤霉素，篩選被慢病毒感染的細(xì)胞，各組細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的感染效率。重新消化各組細(xì)胞，使每組的濃度為5×105個(gè)，接種于培養(yǎng)皿中，次日隨機(jī)選擇2皿FABP3組沉默的細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)人的FABP3質(zhì)粒，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液，此時(shí)細(xì)胞被分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、FABP3沉默組、FABP3沉默+空質(zhì)粒組及FABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3質(zhì)檢組，各組細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3各組細(xì)胞中FABP3的蛋白表達(dá)檢測(cè) 取收集的各組細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取各組中的總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量，取50 μg蛋白樣品，按照1∶1的比例與上樣緩沖液混勻，置于100℃的孵育器中變性5 min，后續(xù)依次進(jìn)行點(diǎn)樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、PVDF轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、一抗孵育(FABP3、GAPDH，1∶1 000稀釋)、洗膜、二抗孵育(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋)、TBST洗膜，ECL發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析FABP3的蛋白表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。以1×105個(gè)/孔將各組細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，取懸浮細(xì)胞再加入5 μl的Annexin-V和PI，充分混勻后置于室溫環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，再加入400 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 以5×105個(gè)/孔將各組細(xì)胞接種于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，72 h后收集細(xì)胞，按照1.3方法提取細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白含量，以GAPDH作為內(nèi)參，分析Cleaved caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FABP3在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá) 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組及FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組FABP3蛋白表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)ABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2FABP3對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組細(xì)胞凋亡率顯著低于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3： FABP3沉默組；4：FABP3沉默+空質(zhì)粒組；5：FABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組；與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01；與FABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組比較：2)P<0.01；下圖同圖1 FABP3在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 FABP3對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

2.3FABP3對(duì)Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)；FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，F(xiàn)ABP3沉默+過(guò)表達(dá)人FABP3組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質(zhì)粒組(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 FABP3對(duì)Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

心血管疾病是危害人類健康、影響中老年人生活質(zhì)量的主要疾病，其主要機(jī)制是心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，最后引起心力衰竭。心肌細(xì)胞凋亡是機(jī)體在一系列的程序控制作用下的一種病理過(guò)程，研究引起心肌細(xì)胞凋亡的基因及影響其凋亡的信號(hào)通路對(duì)于阻斷凋亡發(fā)生、維持或改善心功能、防止心肌細(xì)胞數(shù)目減少具有重要意義〔5〕。FABP3位于人染色體1p33-p32，編碼133個(gè)氨基酸，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，參與轉(zhuǎn)運(yùn)代謝及脂肪酸吸收，同時(shí)通過(guò)一系列過(guò)程為心肌提供能量〔6〕。研究顯示，過(guò)表達(dá)FABP3后能使心肌細(xì)胞的分化受到抑制，沉默F(xiàn)ABP3的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，胞內(nèi)ATP生成減少，心肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)異?！?〕。本研究也通過(guò)表達(dá)FABP3和沉默F(xiàn)ABP3的方法，研究對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果與前人的研究一致。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體在基因控制下的一種程序性死亡過(guò)程，其過(guò)程需要一系列酶的參與，目前caspase家族及Bcl-2家族是研究最多的兩大家族〔8〕。Caspase3是caspase家族的關(guān)鍵蛋白，是細(xì)胞凋亡過(guò)程主要的終末剪切酶，一般情況下Caspase3在胞質(zhì)中以無(wú)活性的酶原形式存在，受到凋亡信號(hào)刺激后被激活，從而引起細(xì)胞凋亡〔9,10〕。有研究顯示，Caspase3的激活可引起細(xì)胞的凋亡〔11〕。Bcl-2是Bcl-2家族重要的一員，定位于18q21.3染色體，是Bcl-2家族的抑制凋亡基因，許多細(xì)胞凋亡過(guò)程中均可引起B(yǎng)cl-2表達(dá)的下調(diào)，而B(niǎo)cl-2的過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制多種因素降低細(xì)胞的凋亡〔12〕。有研究顯示心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bcl-2的表達(dá)下調(diào)〔13〕。本研究結(jié)果提示，沉默F(xiàn)ABP3的表達(dá)可促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。該研究為心血管疾病的診斷及治療提供了理論基礎(chǔ)。

1Dalal S,Zha Q,Singh M,etal.Osteopontin-stimulated apoptosis in cardiac myocytes involves oxidative stress and mitochondrial death pathway:role of a pro-apoptotic protein BIK〔J〕.Mol Cell Biochem,2016;418(1-2):1-11.

2Dubey PK,Goyal S,Mishra SK,etal.Identification of polymorphism in fatty acid binding protein 3 (FABP3) gene and its association with milk fat traits in riverine buffalo (Bubalus bubalis)〔J〕.Trop Animal Health Prod,2016;48(4):849-53.

3Hasanally D,Edel A,Chaudhary R,etal.Psoriasis is associated with metabolic syndrome and cardiovascular disease.Fatty acid-binding proteins (FABP) have been recognized as predictors of these systemic disorders.The aim of this study was to assess correlations between levels of serum heart and adipocyte fatty acid-binding proteins (FABP3,FABP4) and disease severity,indicators of inflammation or metabolic disturbances,and topical treatment〔J〕.Lipids,2017;52(1):51-60.

4Yao DW,Luo J,He QY,etal.Thyroid hormone responsive (THRSP) promotes the synthesis of medium-chain fatty acids in goat mammary epithelial cells〔J〕.J Dairy Sci,2016;99(4):3124-33.

5Corbalan JJ,Vatner DE,Vatner SF.Myocardial apoptosis in heart disease:does the emperor have clothes〔J〕?Basic Res Cardiol,2016;111(3):1-13.

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12Delbridge ARD,Grabow S,Strasser A,etal.Thirty years of BCL-2:translating cell death discoveries into novel cancer therapies〔J〕.Nature Rev Cancer,2016;16(2):99-109.

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〔2017-06-07修回〕

(編輯 郭 菁)

R541.1

A

1005-9202(2017)19-4734-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.019

武漢市臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WZ15D17)

楊 名(1971-)，男，碩士，主治醫(yī)師， 主要從事腫瘤內(nèi)科研究。

楊 洋(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師， 主要從事腫瘤內(nèi)科研究。