羅 偉 冀林華 耿 惠 馬曉靜 馬 婕 尹啟超 劉 媛 崔 森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

miR-125b對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制

羅 偉 冀林華 耿 惠 馬曉靜 馬 婕 尹啟超 劉 媛 崔 森

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

目的探討miR-125b對(duì)急性白血病(AL)細(xì)胞人早幼粒白血病細(xì)胞(HL)-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。方法利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor，miR-125b NC轉(zhuǎn)入白血病細(xì)胞HL-60中，RT-PCR法檢測(cè)miR-125b表達(dá)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)A1，CyclinD1，Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。結(jié)果與miR-125b NC比較，miR-125b inhibitor組miR-125b inhibitor表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率提高，細(xì)胞周期阻滯在G1期，CyclinA1，Bcl-2及p-ERK表達(dá)下調(diào)，CyclinD1及Bax表達(dá)上調(diào)(均P<0.01)。結(jié)論miR-125b inhibitor能顯著抑制白血病細(xì)胞HL-60增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與下調(diào)ERK磷酸化水平有關(guān)。

miR-125b；白血??；HL-60；增殖；凋亡

急性白血病(AL)是一種因?yàn)樵煅杉?xì)胞惡性克隆，骨髓中原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞異常增殖并使正常造血功能受抑制的惡性血液腫瘤〔1〕。AL根據(jù)受累的細(xì)胞系可分為急性髓系細(xì)胞白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(AML)，前者約占AL的80%～90%。miRNA是一類高度保守的長(zhǎng)度約21～23 nt的非編碼小RNA分子，能夠靶向結(jié)合于靶基因的mRNA 3′非翻譯區(qū)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降解靶基因，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與機(jī)體發(fā)育、免疫調(diào)控、腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕。研究表明miR-125b在AML患者中高表達(dá)，治療后表達(dá)降低，復(fù)發(fā)后表達(dá)又升高，且同時(shí)過表達(dá)miR-125b能促使白血病細(xì)胞急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株(NB4)及人早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)過度增殖，反義寡核苷酸干擾miR-125b表達(dá)能有效抑制白細(xì)胞增殖〔3～5〕，但具體作用未知。本研究將進(jìn)一步探討miR-125b對(duì)白血病細(xì)胞HL-60增殖與凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器 兔抗人CyclinA1、CyclinD1、Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；兔抗人細(xì)胞蛋白調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2，p-ERK1/2多克隆抗體均購自美國Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均南京凱基生物技術(shù)有限公司；trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒，LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司；miR-125b inhibitor，miR-125b NC均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2細(xì)胞株 L-60購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基來培養(yǎng)，細(xì)胞每隔2 d左右以1∶3的比例進(jìn)行傳代，并選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-125b的表達(dá) 當(dāng)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%左右，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細(xì)胞中，6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞，再根據(jù)Trizol試劑盒提取細(xì)胞總的RNA，并檢測(cè)總RNA純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。miR-125b上游引物：5′-CGGGATCCCCAGATACTGCGTATGTGTG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGG TCACCTGATCCCATCTAAC-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACA TCGCTCAGACA-3′，下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACT-3′。

1.4MTT法檢測(cè)HL-60細(xì)胞活力 將HL-60細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μl的MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將96孔板中的上清液小心吸取并舍棄，再加入150 μl二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560 nm處測(cè)OD值，細(xì)胞凋亡率=(miR-125b inhibitor組OD值-空白組OD值)/(miR-125b NC組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡情況 將HL-60細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-125b inhibitor及miR-125b NC轉(zhuǎn)染到HL-60細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，miR-125b inhibitor組及miR-125b NC組分別收集1×105/ml個(gè)細(xì)胞，再將500 μl的結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞中并吹打混勻后，接著將5 μl的Annexin V-FITC及5 μl的PI按順序加入已混合均勻的細(xì)胞中，繼續(xù)吹打混勻，并在室溫條件下避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 miR-125b inhibitor組及miR-125b NC組分別收集1×105/ml個(gè)細(xì)胞，再加入5 μl的Rnase(終濃度為10 mg/ml)，吹打混勻后，在37℃條件下孵育1 h，再次加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中CyclinA1，CyclinD1，Bax，Bcl-2及p-ERK蛋白的表達(dá) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染同1.5，在冰浴條件下將6孔板中細(xì)胞刮下來，離心收集細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸10 min進(jìn)行變性，取約30 ng的蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人CyclinA1、CyclinD1、Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體，稀釋度1∶100；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗，稀釋度為1∶200)孵育，4℃過夜；二抗溶液〔辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)〕室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件統(tǒng)計(jì)各抗體條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞48 h后，經(jīng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組中miR-125b表達(dá)量(0.18±0.02)顯著低于miR-125b NC組(0.96±0.09)(P<0.01)，說明miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 miR-125b轉(zhuǎn)染的驗(yàn)證

2.2miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞活力的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞24、48、72、96 h后，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HL-60細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.01)，且在48 h細(xì)胞活力適于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，因此選擇48 h作為后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間。見表1。

表1 miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制率

與miR-125b NC組比較：1)P<0.01,下表同

2.3miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)；細(xì)胞周期G1期明顯比miR-125b NC組延長(zhǎng)，說明miR-125b inhibitor使HL-60細(xì)胞周期阻滯在G1期。見表2。

2.4miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞48 h后，經(jīng)Western印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與miR-125b NC組比較，miR-125b inhibitor組CyclinA1、Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，Bax及CyclinD1表達(dá)量上調(diào)(均P<0.01)。見圖2，表3。

2.5miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞中(p-ERK)水平的影響 miR-125b NC及miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞48 h后，經(jīng)Western印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125b inhibitor組中p-ERK表達(dá)量(0.18±0.02)顯著低于miR-125b NC組(0.49±0.05)(P<0.01)。見圖3。

表2 miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

表3 miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 miR-125b inhibitor對(duì)HL-60細(xì)胞p-ERK水平的影響

3 討 論

miR-125b是秀麗線蟲Line-4的同源基因，有兩個(gè)前體成員，分別為miR-125b-1和miR-125b-2，且研究顯示AML中主要的成熟miR-125b來源于miR-125b-1，另外miR-125b-1位于人類染色體11號(hào)的脆性區(qū)域，提示miR-125b在AML發(fā)生中發(fā)揮著重要作用〔6〕。而且Bousquet等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)AML中miR-125b表達(dá)異常，且高表達(dá)的miR-125b能通過增加小鼠外周血液中白細(xì)胞的數(shù)量來直接誘導(dǎo)白血病的發(fā)生。王麗娜等〔4〕研究表明兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病患者中miR-125b高表達(dá)，緩解后降低，復(fù)發(fā)后又升高。謝晶晶等〔3〕研究也表明在兒童AML患者中miR-125b高表達(dá)。上述研究充分說明了miR-125b在AML中起著癌基因的作用，且又有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125b能促使白血病細(xì)胞NB4及HL-60過度增殖，反義寡核苷酸干擾miR-125b表達(dá)能有效抑制白細(xì)胞增殖〔4，5〕。但是具體的作用機(jī)制未知。本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能顯著降低HL-60細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與劉曉丹等〔5〕研究一致。而腫瘤細(xì)胞的凋亡受限來源于細(xì)胞的惡性克隆，細(xì)胞周期的不可控制，因此調(diào)控細(xì)胞周期點(diǎn)成為眾多抗癌藥物的作用靶點(diǎn)〔8〕。另外本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能延長(zhǎng)G1期，縮短G2期，進(jìn)而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，使細(xì)胞復(fù)制停滯于DNA合成的前期，從而抑制HL-60細(xì)胞的惡性增殖，此結(jié)果也與miR-125b inhibitor在慢性淋巴細(xì)胞K562中的作用一致〔9〕。

細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中研究最為廣泛的是Bcl-2蛋白家族，其中Bcl-2是常見的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號(hào)的傳遞，促進(jìn)細(xì)胞的存活。Bax能自身形成二聚體，將凋亡信號(hào)傳遞給Caspase 3家族，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞凋亡受限制源自于細(xì)胞增殖的不可控制，即細(xì)胞周期的不可控制。其中CyclinA1及CyclinD1是與細(xì)胞周期S和G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，其中CyclinA1對(duì)于S期的驅(qū)動(dòng)具有重要作用，而CyclinD1在G1期開始合成并達(dá)到高峰，能與CDK4/CDK6形成復(fù)合物，進(jìn)而作用于底物，促使轉(zhuǎn)錄起始因子E2F進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)與DNA合成有關(guān)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而促使G1期向S期轉(zhuǎn)變。因此通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，能顯著的調(diào)控細(xì)胞的凋亡與增殖，本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor能顯著下調(diào)CyclinA1及Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax及CyclinD1表達(dá)。

細(xì)胞的凋亡、增殖、分化及細(xì)胞周期調(diào)控受多種信號(hào)通路的調(diào)控，MAPK/ERK信號(hào)通路就是其中的一種〔10〕。EKR是此信號(hào)通路的關(guān)節(jié)調(diào)控點(diǎn)，包括5個(gè)亞族(ERK1～5)，其中EKR1和ERK2研究的最為徹底，能通過自身磷酸化并將信號(hào)傳遞給下游基因進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生命過程。且研究還顯示ERK在AML中被高度激活，miR-125b在頭頸部腫瘤中的作用機(jī)制與MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果表明miR-125b inhibitor對(duì)EKR表達(dá)量影響不大，但能顯著的下調(diào)p-ERK，提示miR-125b inhibitor能通過下調(diào)p-EKR水平進(jìn)而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖。

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〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

R557

A

1005-9202(2017)19-4731-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.018

羅 偉(1977-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事血液病學(xué)研究。