黃 芬 曾江正 盧彥達 洪 濤 何志惠 雷俊華

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤學(xué)部，海南 ?？?571100)

miR-374b靶向PD-1/PD-L1信號通路增強CIK殺傷腫瘤細胞效應(yīng)

黃 芬 曾江正 盧彥達 洪 濤 何志惠 雷俊華

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤學(xué)部，海南 ?？?571100)

目的探討miR-374b在增強細胞因子誘導(dǎo)殺細胞(CIK)抗腫瘤中的作用及機制。方法采用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)CIK，用流式細胞確定CIK細胞群且分選出CIK；流式分析HepG2、PLC、H1299、A549的程序性壞死蛋白(PD)-L1表達；采用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測miR-374b在PD-1上的結(jié)合，siRNA技術(shù)干擾降低miR-374b基因的表達；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測CIK的γ干擾素(IFN-γ)表達；乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CIK體外殺傷腫瘤細胞的能力；過繼回輸檢測CIK體內(nèi)殺傷腫瘤細胞的能力。結(jié)果雙熒光素酶系統(tǒng)顯示miR-374b可以直接作用于PD-1基因上；HepG2、PLC、H1299、A549腫瘤細胞系都有比較高的PD-L1表達；miR-374b抑制劑會降低CIK分泌IFNr的水平，抑制CIK在體內(nèi)和體外對腫瘤細胞的殺傷能力；PD-1 siRNA會提高CIK分泌IFN-γ的水平，增強CIK在體內(nèi)和體外對腫瘤細胞的殺傷能力。結(jié)論miR-374b可以直接作用于PD-1基因的表達，抑制miR-374b可以增強CIK殺傷腫瘤能力，干擾PD-1表達可以提高CIK抑制腫瘤能力。

細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞;PD-1/PD-L1;流式細胞術(shù)

細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞(CIK)是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方案。程序性死亡蛋白(PD)-1可表達于B細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突細胞(DC)，還有活化的單核細胞。其主要表達于活化的T細胞表面，與其配體相互作用，抑制外周組織中的持續(xù)免疫反應(yīng)，并且阻止自身組織受到免疫損傷〔1〕。PD-1 的配體包括 PD-L1 和 PD-L2，主要在巨噬細胞、單核細胞中表達。腫瘤細胞上的PD-L1與T細胞表面的PD-1相互作用，可以誘導(dǎo)對抗腫瘤的T細胞凋亡，從而產(chǎn)生免疫逃逸〔2〕。miR-374b在對抗腫瘤中具有重要作用〔3〕。CIK對抗腫瘤細胞可能通過miR374b調(diào)控PD-1/PD-L1信號通路來進行。本文擬對此進行分析。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 T細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，10%FBS(Gibco 900-108)，青霉素/鏈霉素溶液(Gibco 15140-122)，2-巰基乙醇(Invitrogen 21985-023)。流式熒光抗體：購于Biolegend公司。IFN-γ的ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司。SYBR Green：takara公司。流式儀器：calibur，BD LSRFortessa；分選儀器：BDFACSAria Ⅱ。

1.2CIK 的誘導(dǎo)和培養(yǎng) 將來源于健康志愿者的外周血用淋巴細胞分離液(Ficoll)采用密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞。在48孔板中，每孔種植5×106，加入1 ml RPMI1640培養(yǎng)置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h。收集非貼壁細胞調(diào)整細胞濃度為 1×106/孔，并加入1 000 U/ml γ-干擾素(IFN-γ)繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后加入50 ng/ml抗人CD3 及1 000 U/ml白細胞介素(IL)-2，每3天換液1次，并補充IL-2。在培養(yǎng)14、21、28 d收集細胞并進行免疫表型CD3+CD56+的檢測。

1.3細胞介導(dǎo)的細胞毒作用 采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測。特異性殺傷活性的計算：殺傷活性(%)=〔(OD實驗組-OD總自然釋放)/(OD最大釋放組-OD總自然釋放)〕×100%。

1.4細胞因子刺激 將分離得到的細胞在1 ml T細胞培養(yǎng)基中，加入25 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素并孵0.5 h。再加 2 μmol/L莫能菌素繼續(xù)孵育4～5 h。

1.4.1流式抗體標(biāo)記 (1)表面抗體標(biāo)記：將細胞重懸在100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細胞標(biāo)1 μl流式抗體。置于冰中避光孵育30 min，再加2 ml PBS洗1～2次。(2)胞質(zhì)細胞因子與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記：購買Ebioscience公司胞質(zhì)與核固定液，按照說明書進行固定標(biāo)記。

1.4.2RT-PCR檢測 將分離得到的細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green 進行熒光定量PCR檢測。

1.5過繼回輸實驗 取40只患黑色素瘤鼠的腫瘤組織8 mm3，皮下移植到免疫缺陷的NOD/SCID鼠體內(nèi)，分成4組，每組10只。腫瘤移植1 w后，一組尾靜脈注射PBS作為對照，一組尾靜脈注射培養(yǎng)的人CIK，一組尾靜脈注射加了miR374b抑制劑培養(yǎng)的人CIK，一組尾靜脈注射了加PD-1 siRNA的人CIK。細胞數(shù)為1×107/只，每周注射一次，連續(xù)6 w。觀察記錄小鼠的存活情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)、分離及鑒定CIK(CD3+CD56+T) 在第14天，同時表達CD3+CD56+的CIK比例達到最大(圖1)。由圖2可見，使用PD-1 siRNA作用于CIK后，從mRNA和Western印跡結(jié)果都顯示，CIK的PD-1表達明顯降低。

圖1 流式細胞術(shù)分析與分選CIK細胞

圖2 RT-PCR與Western印跡檢測PD-1 siRNA抑制CIK細胞的PD-1表達

2.2雙熒光素酶系統(tǒng)檢測及驗證miR-374與PD-1的靶向關(guān)系 連接了miR374b的熒光活性低于PGL3質(zhì)?？蛰d(P<0.05)。見圖3。2.3流式細胞儀分析HepG2、PLC、H1299、A549的PD-L1表達情況 PD-L1 在HepG2、PLC、H1299、A549 4種細胞系里都有比較高的表達，其在肺癌細胞株H1299中表達最高，在A549細胞系中表達相對最低(P<0.01)。見圖4。

2.4CIK分泌IFN-γ能力的測定 加入miR374b抑制劑的CIK，相比沒有處理組的，其分泌IFN-γ的能力顯著下降(P<0.01)，而如果轉(zhuǎn)入能降低PD-1表達的PD-1 siRNA后，，其分泌IFN-γ能力顯著上升(P<0.001)。見圖5。

圖3 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測miR-374與PD-1的靶向關(guān)系

圖4 流式細胞儀分析HepG2、PLC、H1299、A549的PD-L1表達

圖5 ELISA檢測CIK細胞分泌IFN-γ水平

2.5LDH釋放法檢測CIK細胞殺傷腫瘤細胞的能力 正常情況下，CIK對4種腫瘤細胞具有良好的殺傷效率。而加入了miR374b抑制劑，CIK對腫瘤細胞殺傷能力明顯減弱。同時采用siRNA將CIK上的PD-1表達降低后，CIK殺傷腫瘤細胞能力又有進一步提高(P<0.05)。見圖6。

A：HopG2 24 h;B:HopG2 48 h;C:PLC 24 h;D:PLC 48 h;E:H1299 24 h;F:H1299 48 h;G:A549 24 h;H:A549 48 h;1)P<0.05,2)P<0.01圖6 LDH釋放法檢測CIK細胞體外抗腫瘤能力

2.6CIK過繼回輸檢測體內(nèi)殺傷腫瘤細胞 過繼回輸了CIK的小鼠，其存活率明顯高于沒有過繼回輸CIK的小鼠。在培養(yǎng)CIK過程中，加入了miR374b抑制劑的CIK抗腫瘤效果明顯降低，加入PD-1 siRNA的CIK抗腫瘤能力顯著升高(P<0.01)。見圖7。

圖7 過繼回輸檢測CIK細胞體內(nèi)抗腫瘤能力

3 討 論

CIK在治療腫瘤中療效顯著，特別是CIK不會被控制免疫力的藥物所抑制，臨床試驗治療也發(fā)現(xiàn)CIK在治療腫瘤病人中具有安全性和有效性〔4〕。采用CIK的免疫治療，通過刺激免疫系統(tǒng)及增加抗腫瘤能力，可以克服化療所帶來的藥物耐受〔5〕。同時在動物實驗中，在將人的淋巴瘤細胞打入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，輸入CIK可以明顯延長小鼠的存活時間〔6〕。本研究也說明CIK對腫瘤確實有比較好的治療效果。PD-1/PD-L1信號通路在抗腫瘤的研究中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1信號通路參與了腫瘤的免疫逃逸，表達PD-L1的腫瘤細胞抵抗T細胞抗腫瘤的能力增強，同時增強其侵襲能力，而如果采用PD-L1阻斷抗體，這種能力被逆轉(zhuǎn)〔7〕。而在PD-1缺失的小鼠中，其體內(nèi)腫瘤細胞生長受到了抑制，并且在腫瘤小鼠模型中采用抗PD-1，PD-L1抗體，可以顯著提高小鼠生存率〔8〕。本研究結(jié)果提示腫瘤細胞表達PD-L1與T細胞上的PD-1結(jié)合后，有助于腫瘤細胞的免疫逃逸。

miRNA通過結(jié)合mRNA，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 跟MAPK信號通路的超活化相關(guān)，在PC-3前列腺癌細胞中過表達miR-374b可以降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A的表達，miR-374b 可以結(jié)合到VEGF-A，從而抑制骨肉瘤細胞的血管形成〔9〕。本研究結(jié)果表明miR-374b參與了PD-1/PD-L1信號通路，通過降低CIK上PD-1表達，解除了腫瘤細胞通過PD-L1對表達PD-1T細胞的免疫抑制作用，從而提高CIK對腫瘤細胞的殺傷作用。

1Boussiotis VA,Chatterjee P,Li L.Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications〔J〕.Cancer J，2014;20(4):265-71.

2Benson DM Jr,Bakan CE,Mishra A,etal.The PD-1/PD-L1 axis modulates the natural killer cell versus multiple myeloma effect:a therapeutic target for CT-011,a novel monoclonal anti-PD-1 antibody〔J〕.Blood，2010;116(13):2286-94.

3Xie J,Tan ZH,Tang X,etal.miR-374b-5p suppresses RECK expression and promotes gastric cancer cell invasion and metastasis〔J〕.World J Gastroenterol,2014;20(46):17439.

4Jiang JT,Shen YP,Wu CP,etal.Increasing the frequency of CIK cells adoptive immunotherapy may decrease risk of death in gastric cancer patients〔J〕.World J Gastroenterol,2010;16(48):6155-62.

5Liu P,Chen L,Huang X.The antitumor effects of CIK cells combined with docetaxel against drug-resistant lung adenocarcinoma cell line SPC-A1/DTX in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Biother Radiopharm,2009;24(1):91-8.

6Yun YS,Hargrove ME,Ting CC.In vivo antitumor activity of anti-CD3 induced activated killer cells〔J〕.Cancer Res,1989;49(17):4770-4.

7Spranger S,Koblish HK,Horton B,etal.Mechanism of tumor rejection with doublets of CTLA-4,PD-1/PD-L1,or IDO blockade involves restored IL-2 production and proliferation of CD8(+) T cells directly within the tumor microenvironment〔J〕.J Immunother Cancer，2014;2(1):3.

8Iwai Y,Terawaki S,Honjo T.PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells〔J〕.Int Immunol,2005;17(2):133-44.

9Miller PC,Clarke J,Koru-Sengul T,etal.A novel MAPK-microRNA signature is predictive of hormone-therapy resistance and poor outcome in ER-positive breast cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2015;21(2):373-85.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

R3

A

1005-9202(2017)19-4724-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.015

2016海南省科技項目資助(No.ZDYF2016107)

曾江正(1978-)，男，碩士，主要從事腫瘤化療及生物免疫治療研究。

黃 芬(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事實體腫瘤的生物免疫治療研究。