王景妍 王博宇 尹延麗 曦 巖 郭家娟 李相軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130116)

解毒通絡(luò)方抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠的膠原合成

王景妍1王博宇1尹延麗1曦 巖1郭家娟1李相軍2

(長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130116)

目的觀察解毒通絡(luò)方對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷后膠原合成的干預(yù)作用。方法成年Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、模型組、解毒通絡(luò)方高、中、低劑量組和ACEI組。解毒通絡(luò)方組給予解毒通絡(luò)方?jīng)_劑懸液10、20、30 g/kg灌胃，ACEI組給予卡托普利水溶液0.005 g/kg灌胃，對照組和模型組均給予生理鹽水灌胃。7 d后，ELISA法檢測各組大鼠血漿血管緊張素(Ang)Ⅱ含量；堿水解法測定心肌組織羥脯氨酸(Hyp)含量；免疫組化方法檢測心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1表達。結(jié)果與對照組比較，模型組血清 AngⅡ含量及心肌Hyp含量均明顯升高(P<0.05)，心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ及TGF-β1蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，解毒通絡(luò)方各劑量組血清 AngⅡ含量及心肌 Hyp 含量均降低(P<0.05)，心肌Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1蛋白表達明顯減少(P<0.05)；與ACEI組比較，解毒通絡(luò)方高劑量組TGF-β1蛋白的陽性表達面積減少(P<0.05)。結(jié)論解毒通絡(luò)方可以有效抑制異丙腎上腺素所致的大鼠心肌膠原合成，其機制可能與抑制AngⅡ生成及干擾心肌TGF-β1信號通路有關(guān)。

心肌損傷；膠原；血管緊張素Ⅱ；TGF-β1；解毒通絡(luò)方

心肌纖維化(MF)屬于中醫(yī)學(xué)的“心悸”“胸痹”“怔忡”“痰飲”等范疇，是指心肌組織中的膠原纖維過量沉積，膠原容積分數(shù)和膠原濃度顯著增加，各型膠原比例失調(diào)以及排列紊亂，可導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降，影響心臟的正常收縮與舒張，是多種常見心臟疾病走向終末期心臟病發(fā)展的一個必然過程，是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵〔1〕。阻止或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化是延緩心力衰竭、減少心律失常發(fā)生的重要手段〔2〕。檢測心肌組織中膠原濃度和膠原容積是界定心肌纖維化的金標準。目前認為，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的激活是導(dǎo)致心肌纖維化的主要因素，而血管緊張素(Ang)Ⅱ是RAAS中起主要生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)〔3〕。靳宏光等〔4〕發(fā)現(xiàn)解毒通絡(luò)方中的藥物有降低AngⅡ的作用。AngⅡ可刺激轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達，也可刺激體外培養(yǎng)的大鼠新生心肌成纖維細胞促進對TGF-β1的旁分泌而致心肌肥大〔5〕。本研究進一步探討解毒通絡(luò)方對心肌纖維化初期膠原合成的干預(yù)作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 解毒通絡(luò)方(夏枯草顆粒劑、牛膝顆粒劑和茺蔚子顆粒劑，均由長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供)；卡托普利(25 mg/片，杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：T15H048)；鹽酸異丙腎上腺素(Sigma-adrich，批號：1351005)；一步法聚合物檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：16G76D07)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K152317J)；羥脯氨酸試劑盒(堿)(南京建成生物工程研究所，批號：KGT030-2)；大鼠AngⅡ ELISA試劑盒(上海美軒生物科技有限公司，批號：MEXN-R1019)。

1.2主要儀器 FAIO04電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、OlympusDX40光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)、可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3實驗動物及分組 將 30只特殊清潔級(SPF)雄性 Wistar 大鼠(體重180～200 g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)隨機分為對照組、模型組、解毒通絡(luò)方低劑量組、中劑量組、高劑量組及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)組。除對照組外，其余各組均行鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射(5 mg/kg 體重)，以復(fù)制大鼠心肌纖維化模型。造模當天，解毒通絡(luò)方高、中和低劑量組大鼠按相應(yīng)劑量(30、20、10 g/kg)灌胃給藥，ACEI組大鼠灌服卡托普利水溶液(0.005 g/kg)，其余各組灌服等體積生理鹽水。于造模后7 d處死大鼠，取心臟進行相關(guān)指標檢測。

1.4血清AngⅡ檢測 按ELISA試劑盒使用說明書進行血清 AngⅡ檢測，主要步驟：①每凹孔加入50 μl用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的心肌組織標本，對照孔加蒸餾水50 μl，30℃作用30 min。②洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗5次，每次1 min。③各孔加入50 μl辣根過氧化物酶標記的檢測抗體溶液，對照孔不加，37℃作用30 min。④洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗5次，每次1 min。⑤所有孔加入底物A，B各50 μl，37℃避光孵育10 min。⑥每孔加終止液50 μl。⑦觀察記錄結(jié)果：用酶標儀在450 nm波長下測量OD值。

1.5心肌組織羥脯氨酸(Hyp)測定 取100 mg心尖心肌組織，用堿水法，按照試劑盒說明，在λ=550 nm 波長處用分光光度法測定心肌組織Hyp的含量，所得值/0.134即為心肌中膠原蛋白的含量。

1.6觀察心?、裥湍z原(Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)和TGF-β1蛋白的表達 采用免疫組化方法，切片置于二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min，無水酒精，95%、85%、75%酒精各2 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，微波爐抗原修復(fù)(枸櫞酸鉀液為抗原修復(fù)液)，冷卻至室溫，PBS浸泡5 min反復(fù)3次，3% H2O2去離子水孵育5 min，滴加一抗(Col Ⅰ、Col Ⅲ，稀釋度均為1∶100；TGF-β1稀釋度均為1∶200)，4℃過夜；PBS 浸泡5 min反復(fù)3次，每張切片滴加生物素化二抗(PV-6000山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物)，37℃恒溫孵育20 min，DAB 鏡下觀察顯色；反應(yīng)結(jié)束后光學(xué)顯微鏡下觀察染色，陽性染色結(jié)果顯示為細胞質(zhì)的棕黃色顆粒；蘇木素復(fù)染、脫水、透明封片后鏡下檢測。采用Image J圖像分析，測量陽性表達面積均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。

2 結(jié) 果

2.1解毒通絡(luò)方對大鼠血清AngⅡ含量的影響 模型組血清 AngⅡ含量明顯高于對照組(P<0.05)，解毒通絡(luò)方各劑量組血清 AngⅡ含量明顯低于模型組(P<0.05)，解毒通絡(luò)方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表 1。

2.2解毒通絡(luò)方對大鼠心肌組織Hyp含量的影響 模型組心肌組織Hyp含量明顯高于對照組(P<0.05)，解毒通絡(luò)方低、中劑量組心肌組織Hyp含量明顯低于模型組(P<0.05)，解毒通絡(luò)方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.3解毒通絡(luò)方對心肌膠原蛋白表達的影響 模型組Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值均明顯高于對照組(P<0.05)，而解毒通絡(luò)方低、中劑量組Col Ⅰ蛋白的陽性表達面積值低于模型組(P<0.05)，解毒通絡(luò)方中、高劑量組Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值低于模型組(P<0.05)，而Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值在解毒通絡(luò)方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清AngⅡ及心肌組織Hyp含量比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

表2 各組大鼠心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ陽性表達面積比較

與模型組比較:1)P<0.05；與對照組比較:2)P<0.05

2.4解毒通絡(luò)方對心肌TGF-β1蛋白表達的影響 模型組TGF-β1蛋白的陽性表達面積值〔(11.50±1.98)%〕明顯高于對照組〔(4.30±1.70)%,P<0.05〕，解毒通絡(luò)方低、中、高劑量組TGF-β1蛋白的陽性表達面積值〔(9.50±1.41)%,(7.60±1.41)%,(6.70±0.42)%〕明顯低于模型組(P<0.05)，而ACEI組〔(11.50±1.98)%〕高于解毒通絡(luò)方高劑量組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌 Col Ⅰ免疫組化結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠心肌 Col Ⅲ免疫組化結(jié)果(×200)

圖3 各組大鼠心肌 TGF-β1免疫組化結(jié)果(×200)

3 討 論

由于心肌損傷的致病原因很多，且臨床表現(xiàn)無特異性，故中醫(yī)臨床診療需要辨病與辨證相結(jié)合，因人、因時、因病情而遣方用藥，以發(fā)揮中醫(yī)藥特色。黃永生教授根據(jù)多年臨床實踐經(jīng)驗提出以解毒通絡(luò)方治療心肌損傷，并且認為其病機關(guān)鍵為“毒傷血絡(luò)”。毒之產(chǎn)生為陰陽失衡，臟腑功能失調(diào)，氣血運行失暢，進而使體內(nèi)的生理或病理產(chǎn)物不能及時排出，蘊結(jié)于體內(nèi)對機體造成損傷。本著治病求本的原則，本方由夏枯草、牛膝、茺蔚子組成，其中夏枯草味苦辛、性寒，有疏通氣血的功效，其通絡(luò)散結(jié)之能恰以調(diào)暢營氣以散毒，是該方的君藥；牛膝味甘酸，性平，具有補益肝腎，滋陰潛陽之功，為臣藥；茺蔚子味辛甘、微苦、微寒，性涼，具順氣活血化瘀之功，祛瘀而通，上行而下達為佐使藥。三藥組合可使肝腎陰陽平衡，氣血暢通，營行毒除而通絡(luò)。通過多項實驗證實此三味藥在某種程度上有類似 ACEI的作用機制〔6〕。動物實驗及體外培養(yǎng)的成纖維細胞研究表明，經(jīng)ACEI治療或處理后能減少膠原合成，從而預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化〔7〕，其主要機制為降低循環(huán)和心臟局部Ang Ⅱ的濃度。這是ACEI發(fā)揮其抗纖維化作用的主要途徑，在此作為陽性對照探討解毒通絡(luò)方的作用機制。

有研究表明，RAAS在心肌纖維化過程中扮演了關(guān)鍵角色，該系統(tǒng)的激活可使循環(huán)和心肌局部的 Ang Ⅱ濃度增加，進而通過釋放、激活一系列細胞因子如TGF-β1，引起細胞外基質(zhì)大量增生和過度積聚，導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生〔8〕。Hyp含量的高低在心肌纖維化的評估中有重要意義，可反映心肌膠原蛋白的含量，從而判斷心肌間質(zhì)細胞增殖和纖維增生的程度。本研究表明，異丙腎上腺素激活RASS中Ang Ⅱ釋放，可誘導(dǎo)大鼠心肌膠原合成增加，加速心肌纖維化的進程。解毒通絡(luò)方可以通過抑制RAAS中Ang Ⅱ的釋放，進而減少心肌膠原蛋白的含量，進一步阻止心肌纖維化的發(fā)展進程。

心肌膠原有5種，以Ⅰ、Ⅲ型為主，Ⅰ型約占心肌膠原總數(shù)的80%，纖維粗，有較大的僵硬度和很強的抗牽拉特性，用于保持室壁的強度；Ⅲ型約占11%，纖維較細，伸展性和彈性較大，與室壁彈性有關(guān)。解毒通絡(luò)方可不同程度改善Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的沉積，從而干預(yù)心肌纖維化的形成。TGF-β1是一種多功能的蛋白肽，能增加以膠原為主的間質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，為諸多因素導(dǎo)致心肌纖維化最后的共同中介之一。近年研究還發(fā)現(xiàn)，RAAS激活、Ang Ⅱ增高引起心肌損傷、心室重構(gòu)均與 TGF-β1 增加有關(guān)，在心肌纖維化病程中，Ang Ⅱ可上調(diào) TGF-β1受體表達，增強TGF-β1作用的敏感性，而TGF-β1則抑制細胞外基質(zhì)降解、增加細胞外基質(zhì)mRNA表達和蛋白質(zhì)合成〔9，10〕。本研究可見，解毒通絡(luò)方可有效降低心肌組織中TGF-β1蛋白的表達，抑制細胞外基質(zhì)合成、增加其降解。

綜上，解毒通絡(luò)方通過抑制被異丙腎上腺素激活的RASS中AngⅡ的釋放，而影響TGF-β1蛋白的合成，通過降低蛋白的合成和增加蛋白酶抑制物水平而阻滯基質(zhì)降解，最終促進心肌纖維化發(fā)生及發(fā)展〔11，12〕，其作用機制與ACEI類藥物相似。

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〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R285.5

A

1005-9202(2017)19-4719-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.013

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81503544)

1 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心病科 2 吉林大學(xué)藥學(xué)院

郭家娟(1978-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)心血管病證研究。

王景妍(1990-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)心血管病證研究。