李 季 苗智瑩 蔡錦芳 鄒 林 李宗玉 崔宜棟

(鄭州市第一人民醫(yī)院骨外科，河南 鄭州 450004)

大鼠皮膚的保存與撕脫傷模型冷藏皮延遲植皮的實(shí)驗(yàn)研究

李 季1苗智瑩2蔡錦芳1鄒 林1李宗玉1崔宜棟3

(鄭州市第一人民醫(yī)院骨外科，河南 鄭州 450004)

目的對(duì)比研究冷藏皮和反植皮的成活率及冷藏皮和液氮冷凍皮膚的病理學(xué)變化。方法分析冷藏皮延遲植皮的成活率及病理學(xué)變化情況，并對(duì)冷藏皮和液氮冷凍皮進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡率觀察。結(jié)果動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，即時(shí)回植組與冷藏皮24 h、48 h組成活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率明顯低于即時(shí)回植組(P<0.05)，提示冷藏皮回植黃金時(shí)間為48 h以內(nèi)。大鼠皮膚細(xì)胞空泡變性率比較，冷藏皮在第1,3,5,10天的空泡變性率均高于即時(shí)回植組(P<0.05)，但第1天的空泡變性率接近即時(shí)回植組，而第3,5,10天的空泡變性率與即時(shí)回植組差距較大。液氮組第1,3,5,10天的空泡變性率也高于即時(shí)回植組(P<0.05)，但是空泡變性率均較接近即時(shí)回植組，組間絕對(duì)數(shù)差距也較冷藏組的組間差距小。大鼠皮膚細(xì)胞凋亡率比較，冷藏皮在第1,3,5,10天的凋亡率均高于即時(shí)回植組(P<0.05)，但第1、3天的凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而與第5、10天的凋亡率差距較大。液氮組的第1,3,5,10天的凋亡率明顯高于即時(shí)回植組(P<0.05)，凋亡率也明顯高于冷藏組。結(jié)論皮膚冷藏48 h以內(nèi)為回植的安全期限，液氮冷藏皮膚，細(xì)胞變性率低，但是凍存和解凍過(guò)程可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。

皮膚撕脫傷；冷藏皮；液氮凍存皮膚

撕脫傷手術(shù)大多采用即時(shí)削薄回植或徹底去除脂肪組織，即時(shí)反植皮覆蓋創(chuàng)面，面積小者手術(shù)時(shí)間不長(zhǎng)，對(duì)機(jī)體影響不大；但是當(dāng)大面積撕脫傷時(shí)，對(duì)皮膚處理時(shí)間長(zhǎng)，傷者創(chuàng)面暴露長(zhǎng)，出血多，由創(chuàng)面蒸發(fā)丟失的液體量也增加，導(dǎo)致患者血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定，甚至大面積出血凝血，導(dǎo)致血小板短時(shí)間大量消耗，出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)〔1,2〕。另外，創(chuàng)面大面積長(zhǎng)時(shí)間暴露，傷者的感染率高，因此，傳統(tǒng)對(duì)大面積撕脫傷的處理不符合損傷控制治療原則〔3〕。相關(guān)研究顯示，冷藏皮回植可減少創(chuàng)面暴露時(shí)間，減少醫(yī)源性創(chuàng)傷，有充分時(shí)間處理皮膚，利于后期修復(fù)〔4〕。對(duì)皮膚保存辦法的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，液氮冷凍能有效降低細(xì)胞的空泡變性率，但是凍存復(fù)蘇的皮膚細(xì)胞凋亡率較冷藏皮膚明顯增高，可能是由于皮膚冷凍與解凍的過(guò)程中，溫度的急劇變化誘發(fā)凋亡程序開啟，進(jìn)而導(dǎo)致上述變化。本研究對(duì)比冷藏皮和反植皮的成活率，并同時(shí)分析冷藏皮和液氮冷凍皮膚的病理學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1主要試劑 低糖DMEM固體培養(yǎng)基(四季青公司，中國(guó))，胎牛血清，免疫組化凋亡試劑盒(sigma，美國(guó))

1.2動(dòng)物 Wistar大鼠102只，體重200～215 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物證書合格編號(hào)：SCXK(京)2009-0004，由天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。所有大鼠按照天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員(TCM-LAEC2015026)的指導(dǎo)原則處理。

1.3方法

1.3.1大鼠皮膚撕脫傷模型 大鼠褪毛，在無(wú)菌條件下，將大鼠臀部切取大約2 cm×2 cm帶全脂肪層皮膚，形成撕脫傷模型。然后將臀部切取皮膚去除脂肪層，放入無(wú)菌注射器中4℃冷藏備用。等待植皮的大鼠創(chuàng)面，油紗覆蓋包扎備用。植皮后打包加壓包扎，1 w后打開加壓包扎判斷成活情況。

1.3.2大鼠皮膚液氮凍存 大鼠皮膚撕脫傷模型建立后，將去除脂肪層的大鼠皮膚分裝到放有血清和二甲基亞砜的無(wú)菌凍存管內(nèi)，將凍存管密封，貼上標(biāo)簽，放入已做好標(biāo)記的袋中；將凍存管放到程序降溫盒-80℃凍存，24 h后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

1.3.3大鼠液氮凍存皮膚復(fù)蘇 從液氮中取出大鼠皮膚凍存管，迅速在37℃溫水中輕輕搖動(dòng)令其盡快融化，盡量短的時(shí)間融化后，取出置于冰上。10 ml DMEM培養(yǎng)基稀釋，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，再加入適量DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、7.5% CO2孵箱中培養(yǎng)1 h。從37℃孵箱中取出凍存管，無(wú)菌條件下打開凍存管，轉(zhuǎn)入離心管，加入10倍以上培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄上清保存?zhèn)溆谩７譃樗好撈ぜ磿r(shí)回植組(脫皮后立即植皮)，冷藏皮24、48、72、120 h回植組，冷藏皮168 h回植組，分別在對(duì)應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行回植手術(shù)。

1.3.4dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將皮膚蠟塊樣本用二甲苯浸洗切片2次，每次5 min，梯度乙醇水化，0.85% NaCl浸洗5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗，浸入4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗，每片加入100 μl 20 μg/ml Proteinase K室溫處理15 min。PBS浸洗，浸入4%多聚甲醛固定5 min；PBS浸洗，加100 μl平衡液，濕盒平衡10 min。制備TUNEL反應(yīng)混合液：冷藏組和液氮凍存組用1 μl rTdT加1 μl 生物素標(biāo)記的dUTP加98 μl平衡液混勻；即時(shí)回植組先加入100 μl DNase1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 μl 10 U/ml DNase1酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min，加100 μl TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片在37℃暗濕盒中反應(yīng)1 h。浸入2×SSC 15 min終止反應(yīng)，PBS浸洗，浸入0.3% H2O215 min，PBS浸洗，加100 μl鏈霉親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)30 min，PBS浸洗，加100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)混合液10 min，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時(shí)，去離子水沖洗。經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染后，3 s后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明1 min、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，背景呈紫藍(lán)色。皮膚表皮細(xì)胞陽(yáng)性或顆粒細(xì)胞中超過(guò)50%細(xì)胞陽(yáng)性，判斷該細(xì)胞凋亡。計(jì)算各組凋亡率：凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/整張切片中計(jì)數(shù)總數(shù)×100%。大鼠皮膚蘇木素-伊紅(HE)切片：分別選擇0、1、3、5、10 d的大鼠皮膚，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚表皮細(xì)胞的空泡細(xì)胞，每張切片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算空泡變性細(xì)胞率，每組做三張切片計(jì)數(shù)。計(jì)算各組表皮細(xì)胞空泡變性率：空泡變性率=空泡變性細(xì)胞數(shù)/整張切片中計(jì)數(shù)總數(shù)×100%。

1.3.5大鼠冷藏皮電鏡觀察 取大鼠冷藏皮24 h和168 h兩個(gè)樣本，按程序送濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院電子顯微鏡室做電鏡切片并照片。觀察切片的細(xì)胞器及細(xì)胞核染色質(zhì)，是否有細(xì)胞器水腫、顆粒變性及核染色質(zhì)濃聚反應(yīng)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠皮膚撕脫傷模型冷藏皮回植成活率分析 即時(shí)回植組〔85.71%(12/14)〕與冷藏皮24 h〔80.95%(17/21)〕、48 h組〔72.22%(13/18)〕成活率比較接近，冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率分別為47.06%(8/17)，31.25%(5/16)，20.00%(3/15)?？梢?，隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，成活率逐漸下降。

2.2多個(gè)樣本構(gòu)成比之間兩兩比較分析 即時(shí)回植組與冷藏皮24 h、48 h組成活率之差分別為4.76%、13.49%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.134,0.838；P=0.714，0.359)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植組成活率明顯低于即時(shí)回植組，構(gòu)成比之差分別為38.05%、54.46%、65.71%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.011,9.019,12.523；P=0.025,0.003,0.000)；冷藏皮48 h內(nèi)回植的成活率明顯高于48 h以后回植成活率(P<0.05)。

2.3大鼠皮膚4℃冷藏細(xì)胞和液氮凍存細(xì)胞凋亡率分析 大鼠皮膚4℃冷藏在第1,2天的表皮細(xì)胞凋亡率基本無(wú)差別，冷藏3 d以上的大鼠皮膚表皮細(xì)胞凋亡率明顯增加，凋亡率與冷藏時(shí)間正相關(guān)。大鼠皮膚經(jīng)過(guò)液氮凍存和解凍復(fù)蘇后，表皮細(xì)胞凋亡率顯著上升，第3天和第5天的凋亡率無(wú)顯著差異，第10天凋亡率明顯上升，凋亡率與解凍復(fù)蘇后時(shí)間正相關(guān)。大鼠皮膚4℃冷藏與液氮凍存細(xì)胞凋亡率計(jì)數(shù)均與時(shí)間呈正相關(guān)，第1天和第5天的凋亡率相近；第3天、第10天液氮組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于冷藏組。見表1。

表1 大鼠皮膚4℃冷藏細(xì)胞和液氮凍存細(xì)胞凋亡率比較

與即時(shí)回植組比較：1)P<0.05，下表同

圖1 大鼠皮膚病理切片空泡變性(HE)與凋亡細(xì)胞原位雜交結(jié)果(×400)

2.4大鼠皮膚4℃冷藏細(xì)胞和液氮凍存細(xì)胞空泡變性分析 見圖1，表2。大鼠皮膚4℃冷藏細(xì)胞空泡變性率雖然顯著高于即時(shí)回植組，但是第1天的表皮細(xì)胞空泡變性率比較接近于即時(shí)回植組；而第3天以后，空泡變性率時(shí)間依賴性地增高。在第1天的空泡變性率與冷藏組第1天類似。液氮凍存的新鮮組與第1,3,5,10天的空泡變性率與冷藏組相似，也呈現(xiàn)時(shí)間正相關(guān)。大鼠皮膚4℃冷藏與液氮凍存細(xì)胞空泡變性數(shù)比較，第0天和第1天的細(xì)胞空泡變性計(jì)數(shù)基本一致。從第3天開始，液氮組的細(xì)胞空泡變性計(jì)數(shù)低于冷藏組。

表2 大鼠皮膚4℃冷藏細(xì)胞及液氮凍存細(xì)胞空泡變性計(jì)數(shù)比較

2.5電子顯微鏡觀察分析 電鏡觀察，大鼠冷藏皮24 h組皮膚細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯水腫，無(wú)核染色體聚集等表現(xiàn)；而168 h組可見明顯細(xì)胞器水腫，細(xì)胞核的染色體聚集表現(xiàn)。見圖2。

圖2 電子顯微鏡觀察回植皮不同冷藏時(shí)間的情況(×400)

3 討 論

本次研究證實(shí)，大鼠皮膚冷藏24 h后表皮空泡變性率明顯增加，但是在24 h內(nèi)的空泡變性率與新鮮皮膚的空泡變性率接近，而在72 h后，表皮空泡變性率大大增加。對(duì)于皮膚表皮細(xì)胞的凋亡率的研究也發(fā)現(xiàn)，24 h后的皮膚表皮細(xì)胞凋亡率明顯增加。液氮保存復(fù)蘇后的大鼠表皮細(xì)胞，空泡變性率雖然也較新鮮組增加，但是大大低于冷藏組各時(shí)間段的空泡變性率，而隨著凍存時(shí)間的推移，凋亡率大幅度增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同一時(shí)段的冷藏皮。

皮膚細(xì)胞脫離機(jī)體后，在缺氧缺血情況下，不可避免地發(fā)生細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞變性、凋亡等〔6〕。空泡變性有時(shí)與氣球樣變性難以區(qū)分，是細(xì)胞水腫的一種形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)細(xì)胞水腫，有明確的空泡，有時(shí)胞質(zhì)疏松，都屬于細(xì)胞水腫變性的形態(tài)學(xué)變化〔7〕。細(xì)胞變性是組織細(xì)胞能耐受刺激因素時(shí)做出的適應(yīng)反應(yīng)，超過(guò)其耐受程度的因素有缺氧、物理因素、化學(xué)因素、生物因素及免疫因素〔8〕。變性是壞死的前奏，但是大部分初期的變性在損害因素去除后有可逆的可能。細(xì)胞一旦壞死，開始無(wú)形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變；死亡6～10 h后，自溶性改變明顯時(shí)光鏡、肉眼可辨，細(xì)胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂、核溶解等變化〔9〕。通過(guò)對(duì)大鼠皮膚冷藏和液氮凍存的實(shí)驗(yàn)研究，我們?cè)诠忡R下發(fā)現(xiàn)了表皮細(xì)胞空泡變性的變化情況，說(shuō)明在離體缺氧的情況下，表皮細(xì)胞雖然經(jīng)過(guò)低溫冷藏和液氮凍存，降低了細(xì)胞的代謝，減少耗氧，但是隨著時(shí)間的推移，兩種保存方法的皮膚表皮細(xì)胞空泡變性率逐漸增加，液氮凍存對(duì)于代謝的控制明顯優(yōu)于冷藏，表現(xiàn)為空泡變性率遠(yuǎn)低于冷藏組。本組研究發(fā)現(xiàn)脫離開血運(yùn)后的皮膚組織，可能已經(jīng)啟動(dòng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和線粒體通路，開始了凋亡的進(jìn)程。液氮組在第72 h后隨著時(shí)間的推移凋亡率迅速上升，大大高于冷藏組的凋亡率。

綜上所述，皮膚冷藏48 h以內(nèi)為回植的安全期限，液氮冷藏皮膚細(xì)胞變性率低，但是凍存和解凍過(guò)程可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加，其臨床應(yīng)用的可能性需進(jìn)一步研究。筆者推測(cè)，隨著時(shí)間的推移液氮低溫的刺激使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增加，啟動(dòng)凋亡程序。因此，皮膚液氮保存中如何減少凋亡、減少寒冷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激刺激，是重要的研究方向。

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2熊健斌,孫宏志,王棟棟,等.低溫延遲回植技術(shù)在肢體大面積皮膚撕脫傷中的應(yīng)用〔J〕.創(chuàng)傷外科雜志,2014;16(5):433-5.

3宋連新,彭阿欽,宋朝暉,等.Ⅰ期傷肢取皮移植治療四肢大面積皮膚撕脫傷〔J〕.中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志,2015;8(5):437-9.

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6Demiri E,Papaconstantinou A,Dionyssiou D,etal.Reconstruction of skin avulsion injuries of the upper extremity with integra(?) dermal regeneration template and skin grafts in a single-stage procedure〔J〕.Arch Orthop Trauma Surg,2013;133(11):1521-6.

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〔2017-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

R75

A

1005-9202(2017)19-4709-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.009

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30973018)

1 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院骨外科

2 濟(jì)南市婦幼保健院桿石橋社區(qū)服務(wù)中心

3 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科

蔡錦芳(1942-)，男，主任醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷創(chuàng)面修復(fù)方面的研究。

李 季(1969-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨科創(chuàng)傷及腫瘤創(chuàng)面修復(fù)方面的研究。