張 煜 孟冬麗 楊 磊 張 偉 卜勇軍 吳 輝 石如玲

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

高飽和脂肪飲食對老年大鼠學習記憶和腦Aβ生成的影響及機制

張 煜 孟冬麗 楊 磊1張 偉 卜勇軍2吳 輝2石如玲2

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的觀察高飽和脂肪飲食對老年大鼠學習記憶和腦β-淀粉樣蛋白(Aβ)生成的影響及機制。方法26只雄性老年大鼠隨機分為對照組和高飽和脂肪組各13只，對照組大鼠給予正常飼料，高飽和脂肪組大鼠給予含15%牛油飼料，喂養(yǎng)3個月。用Morris水迷宮測定大鼠學習記憶能力，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定海馬Aβ含量，用免疫組織化學染色檢測腦內β-淀粉樣前體蛋白(APP)表達，用黃嘌呤氧化酶法測定血清及腦組織總超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果與對照組相比，高飽和脂肪組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，穿越原平臺所在位置次數顯著減少(P<0.01)，腦皮質和海馬區(qū)APP蛋白表達明顯增多(P<0.01，P<0.05)，海馬Aβ含量顯著升高(P<0.01)，血清及腦組織總SOD水平均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。結論高飽和脂肪飲食降低學習記憶能力、增加APP和Aβ水平，其機制可能與降低腦抗氧化能力有關。

高飽和脂肪；學習記憶；β-淀粉樣蛋白；氧化應激；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)病因至今不明。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是AD老年斑的主要成分，來自于β-淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解，Aβ的過度產生和聚集是AD發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。食物脂肪類型與大腦認知功能及AD發(fā)生相關，攝入過多飽和脂肪使AD發(fā)生率升高，而補充多不飽和脂肪則保護認知功能，降低AD的發(fā)生〔1～3〕。動物實驗也發(fā)現食物中增加飽和脂肪及膽固醇損害大鼠認知能力〔4,5〕。本實驗觀察高飽和脂肪飲食對大鼠學習記憶能力和腦Aβ生成的影響及機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及取材 將雄性老年SD大鼠20月齡，華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供，分為對照組和高飽和脂肪組，每組13只。對照組大鼠給予普通飼料，高飽和脂肪組給予高飽和脂肪飼料(普通飼料+15%牛油)，喂養(yǎng)3個月。Morris水迷宮實驗結束1 w后，每組各取3只大鼠，麻醉后4%多聚甲醛全身灌流固定，取腦用于APP免疫組化染色。其余大鼠禁食一夜，麻醉后股動脈放血處死。取血分離血清-20℃保存，用于測定血清總超氧化物歧化酶(SOD)活性。迅速剝腦，分離海馬和大腦皮質置于液氮中，然后-80℃保存，用于測定Aβ和總SOD。

1.2試劑與儀器 主要試劑：Aβ酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(Cusabio公司)、APP單克隆抗體6E10(英國Abcam公司)、二抗和免疫組織化學染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)、SOD測定試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所)；主要儀器：Morris水迷宮(上海移數信息科技有限公司)、全自動酶標儀(Thermo公司)、分光光度計(UNICO公司)、光學顯微鏡(日本Olympus)、形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達)。

1.3Morris水迷宮測試大鼠學習記憶能力 正式實驗前1 d讓大鼠自由游泳2 min熟悉水迷宮環(huán)境。采用定位航行實驗測量學習能力，歷時4 d。每天訓練3次，每次訓練間隔4 min，每次訓練隨機選擇一個入水點。將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓練所有大鼠入水點相同。記錄2 min內找到水下平臺所需的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內未找到平臺，將其引至平臺，這時潛伏期計為120 s。將3次訓練的逃避潛伏期取平均值，反映大鼠的學習能力。定位航行實驗結束后，第5天撤除水下平臺，進行空間探索實驗測定記憶能力。在同一入水點將大鼠放入水中，記錄其120 s內穿越原平臺位置的次數。

1.4APP免疫組織化學染色及圖像分析 將固定后的腦組織脫水、包埋、切片(厚度5 μm)等處理，石蠟切片脫蠟至水后，過氧化物酶封閉，用甲酸修復抗原，采用SP法染色，鼠抗APP抗體1∶50稀釋。顯微鏡下觀察大腦皮質和海馬APP陽性反應細胞的形態(tài)和數目，陽性反應細胞的胞膜和胞質呈棕黃色。400倍光鏡下掃描海馬和皮質圖像，用視野內陽性細胞的平均光密度值表示海馬或皮質APP的蛋白表達量。

1.5ELISA測定海馬Aβ40的含量 稱取100 mg海馬組織加入1 ml冷磷酸鹽緩沖液(PBS)冰浴電動勻漿，勻漿液反復凍融2次后，4℃離心，8 000 r/min，10 min，取上清用于Aβ40含量檢測。

1.6血清及腦皮質總SOD活性的測定 用黃嘌呤氧化酶法測定總SOD活性。待測腦皮質加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4℃離心，3 000 r/min，10 min，上清用于總SOD活性測定及蛋白定量；血清直接用于總SOD活性測定。SOD活性測定方法按照試劑盒說明書進行。

1.7統(tǒng)計學方法 采用t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠學習記憶能力 定位航行試驗中，高飽和脂肪組平均逃避潛伏期〔(51.31±12.70)s〕較對照組顯著延長〔(42.65±9.63)s，P<0.05〕，表明高飽和脂肪飲食使大鼠學習能力下降?？臻g探索試驗中，飽和脂肪組穿越原平臺所在位置的次數〔(4.27±1.16)次〕較對照組顯著減少〔(5.83±1.26)次，P<0.01〕，表明高飽和脂肪飲食使大鼠記憶能力降低。

2.2皮質和海馬區(qū)APP免疫組織化學染色 APP陽性反應物為棕黃色，分布于細胞膜及胞質，細胞核不顯色。與對照組相比，高飽和脂肪組皮質(0.269±0.029)和海馬各區(qū)(0.127±0.010)陽性細胞數量增多，著色增強較對照組顯著增高(0.185±0.014，0.105±0.008，P<0.05，P<0.01)。見圖1。

圖1 各組皮質和海馬APP表達(DAB，×400)

2.3海馬Aβ40含量 高飽和脂肪組海馬Aβ40含量〔(2.77±0.44)pg/mg〕較對照組〔(1.84±0.62)pg/mg〕顯著增高，是對照組的1.5倍(P<0.01)。

2.4血清及腦組織總SOD活性 與對照組血清〔(92.42±4.72)×103U/L〕和腦組織總SOD〔(148.42±13.91)×103U/g〕活性相比，高飽和脂肪組血清〔(82.47±9.47)×103U/L〕及腦組織總SOD活性〔(132.18±11.6)×103U/g〕均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

3 討 論

研究表明高飽和脂肪飲食損害學習記憶能力、增加AD發(fā)生率〔5,6〕。本研究表明高飽和脂肪飲食對學習記憶能力具有損害作用。Aβ是各種原因誘發(fā)AD的關鍵因子，在啟動AD的病理級聯(lián)反應中發(fā)揮關鍵作用。本研究發(fā)現高飽和脂肪飲食大鼠不僅腦內APP表達增多，海馬Aβ40水平也升高，從整體水平上證明高飽和脂肪飲食促進APP表達和Aβ生成，這可能是高飽和脂肪飲食增加AD的機制之一。研究表明氧化應激可增加APP、β分泌酶表達，促進Aβ生成〔7〕；Aβ增多又通過增強氧化應激進一步促進Aβ產生，形成惡性循環(huán)〔8〕。SOD是機體抗氧化體系的重要酶之一，其活力的高低反映機體清除氧自由基的能力。研究表明高脂飲食增強氧化應激〔9〕，降低SOD活性〔10〕。本研究也發(fā)現高飽和脂肪飲食大鼠血清及腦組織抗氧化酶SOD總活性降低，推測高飽和脂肪飲食降低學習記憶能力、促進Aβ生成的機制可能與腦抗氧化能力降低有關。

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〔2016-09-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Effectofhigh-saturated-fatdietonlearningandmemoryandAβgenerationofagedratbrainanditsmechanism

ZHANGYu，MENGDong-Li，YANGLei，etal.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453003，Henan，China

ObjectiveTo explore the effects of high-saturated-fat diet on learning and memory and Aβ generation of rat brain and investigate its mechanism.MethodsTwenty six males aged rats were randomly divided into control and high-saturated-fat groups (n=13 each). The control group was given a normal diet, and the high-saturated-fat group was given high-saturated-fat diet containing 15% beef tallow for three months. The spatial learning and memory abilities were examined by Morris water maze test. Aβ40 content in hippocampal was measured by ELISA. β-amyloid-precursor protein (APP) expression was measured by immunohistochemistry staining. Serum and brain total superoxide dismutase (SOD) activities were measured by detecting xanthine oxidase activity.ResultsCompared with the control group, the average escape latency prolonged and platform crossing number were decreased in the high-fat group. Cerebral cortex and hippocampus APP protein expression and hippocampal Aβ40 content were increased significantly in the high-fat group. Total SOD activities in serum and brain tissue in the high-fat group were significantly lower than those of control group.ConclusionsHigh-saturated-fat diet might reduce the ability of learning and memory and promote Aβ generation, and its mechanism might be related to decreasing antioxidant capacity of brain.

Saturated fat; Learning and memory; β-amyloid; Oxidative stress; Alzheimer′s disease

Q547;R741

A

1005-9202(2017)19-4705-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.007

國家自然科學基金資助項目(No.81500984)；河南省重點科技攻關項目(No.152102310112)

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院

石如玲(1970-)，女，教授，碩士生導師，主要從事脂類代謝與老年癡呆發(fā)病機制研究。

張 煜(1977-)，男，講師，主要從事老年癡呆發(fā)病機制研究。