張英博 費洪新 郭 家 興桂華 潘思文 張曉杰 周忠光

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蝙蝠葛堿對阿爾茨海默病小鼠海馬晚期糖基化終產(chǎn)物受體和核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65的影響

張英博 費洪新 郭 家 興桂華 潘思文 張曉杰 周忠光1

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的探討蝙蝠葛堿(DAU)對阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κBp65的影響。方法雄性小鼠隨機分成對照組、模型組、多奈哌齊組(0.001 g/kg)及DAU高、中、低劑量組(2.4、1.2、0.6 g/kg)。小鼠雙側(cè)海馬微量注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42(2 g/L)和腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)誘導AD小鼠，連續(xù)治療35 d后取材。采用Morris水迷宮(MWM)檢測AD小鼠學習記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測海馬白細胞介素(IL)-1β、IL-6含量，免疫組化(IHC)、實時定量(RT)-PCR和Western印跡檢測海馬RAGE 和NF-κBp65表達。結(jié)果與模型組比較，DAU高、中劑量明顯改善AD小鼠學習記憶能力，明顯降低海馬IL-1β、IL-6、RAGE和NF-κBp65水平(均P<0.05)。結(jié)論DAU通過抑制海馬RAGE和NF-κBp65表達來改善AD小鼠學習記憶能力，以此在AD治療中發(fā)揮重要作用。

蝙蝠葛堿；阿爾茨海默??；晚期糖基化終產(chǎn)物受體

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)退行性疾病之一〔1〕，其特點是β-淀粉樣蛋白(Aβ)〔2〕沉積形成老年斑(SP)〔3〕，Aβ促進小膠質(zhì)細胞(MG)〔4〕和星形膠質(zhì)細胞(As)〔5〕活化而協(xié)同產(chǎn)生白細胞介素(IL)-1β〔6〕、IL-6〔7〕、腫瘤壞死因子(TNF)-α〔8〕等，引起學習記憶能力降低〔9〕、認知障礙和人格障礙等。依據(jù)神經(jīng)血管假說〔10，11〕，Aβ通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)〔12〕轉(zhuǎn)運進入腦，同時通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κBp65〔13〕活化而介導炎癥反應致腦IL-1β、IL-6含量增加，促進AD發(fā)展。祖國醫(yī)藥北豆根有效成分蝙蝠葛堿(DAU)很容易穿過血腦屏障(BBB)〔14〕、抑制膀胱癌EJ細胞株增殖〔15〕、促進細胞凋亡〔16〕、保護腦神經(jīng)元〔17〕、抗肝纖維化〔18〕、增加抗骨質(zhì)疏松療效〔19〕等。然而國內(nèi)外未見文獻報道DAU對AD小鼠海馬RAGE和NF-κBp65影響的相關研究，本實驗探討DAU對AD小鼠海馬RAGE和NF-κBp65的影響。

1 材料和方法

1.1材料 動物：野生型雄性C57BL/6J小鼠(北京維通利華實驗動物技術公司，質(zhì)量合格證號為SCXK(京)2012-0001。小鼠由李寶龍副主任常規(guī)飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。藥品和試劑：DAU(Sigma公司，15013102)；多奈哌齊(重慶植恩藥業(yè)有限公司，20141201)；NF-κBp65(Santa Cruz Biotechnology，sc-109)；RAGE(Boster，ba-1789)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)；IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，20140401)，RNeasy@ Mini Kit(QIAGEN公司)；Aβ1～42、D-半乳糖(Sigma公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純(黑龍江中醫(yī)藥大學周忠光教授、齊齊哈爾醫(yī)學院張英博副教授提供)。儀器：6100型酶標儀(美國RT公司)；STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；ZHDSG型Morris水迷宮(MWM，安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；HMIAS型高清晰度彩色分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術有限公司)等。

1.2方法

1.2.1AD模型制備〔20～25〕小鼠麻醉后，剪去頭頂部毛發(fā)，固定小鼠，STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)定位小鼠海馬，使用微量加樣器于雙側(cè)腦室海馬內(nèi)連續(xù)注入10 μg Aβ1～42(2 g/L)，留針15 min，包扎；同時腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)。對照組C57BL/6J小鼠雙側(cè)腦室和腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2分組與給藥 AD小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組及DAU高、中、低劑量組，每組8只。另設同月齡、同背景C57BL/6J小鼠8只為對照組。對照組、模型組給予生理鹽水灌胃；多奈哌齊組給予多奈哌齊(0.001 g/kg)灌胃；DAU高、中、低劑量組分別給予DAU(2.4、1.2、0.6 g/kg)灌胃，連續(xù)灌胃35 d。

1.2.3MWM檢測小鼠學習記憶能力 采用MWM檢測潛伏期評價小鼠學習能力、游泳距離評價小鼠記憶能力、平臺所在象限游泳時間(目標停留時間)和跨越平臺所在位置次數(shù)(跨平臺次數(shù))綜合評價小鼠學習記憶保持能力。MWM水深20 cm，平臺低于水平面1 cm，水溫(23±2)℃，水池內(nèi)放奶粉形成白色渾濁溶液，平臺放第Ⅳ象限，其中第1、2、3、4天為訓練時間且每次訓練時間60 s，當60 s未找到平臺則將小鼠放平臺10 s，實驗第5天檢測小鼠學習記憶能力。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測海馬IL-1β、IL-6含量 MWM實驗結(jié)束后小鼠斷頭，取小鼠海馬勻漿、靜置，TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)5 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80℃冰箱(日本SANYO公司)保存。在6100型酶標儀(美國RT公司)上450 nm波長處測定吸光度(A)，繪制標準曲線，求小鼠海馬IL-1β、IL-6含量。

1.2.5免疫組化(IHC)檢測海馬RAGE、NF-κBp65表達 MWM實驗結(jié)束后，小鼠心臟灌注，按照IHC試劑盒說明書常規(guī)制備腦石蠟切片，經(jīng)過脫蠟、滅活過氧化物酶、H2O2處理、封閉、滴加一抗和二抗、DAB顯色、復染、脫水、透明、封片等。采用HMIAS型高清晰度彩色分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術有限公司)計數(shù)海馬平均光密度值(MOD)。

1.2.6實時定量(RT)-PCR檢測海馬RAGE、NF-κBp65 mRNA表達 MWM實驗結(jié)束后，取材海馬，Trizol試劑盒提取海馬總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增。設計β-actin、NF-κBp65、RAGE mRNA引物：β-actin正義：5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′，反義：5′-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-3′；NF-κBp65正義：5′-TGTGCGACAAGGTGCAGAAA-3′，反義：5′-ACAATGGCCACTTGCCGAT-3′；RAGE正義：5′-AAAACGACAACCCAGGCGT-3′，反義：5′-ATTCTCTGGCATCTCCGCTTC-3′，引物由上海生工有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃，15 min，85℃ 15 s。RT-PCR條件：預變性95℃ 10 s，循環(huán)95℃ 5 s，60℃ 34 s，擴增40個循環(huán)，使用iQTM5軟件分析PCR樣本Ct值，計算目的基因相對于內(nèi)參基因(β-actin)表達量(2-△△Ct法)。

1.2.7Western印跡檢測海馬RAGE、NF-κBp65表達 MWM實驗結(jié)束后，冰臺上迅速取小鼠海馬，裂解、冰浴、勻漿、離心、測定蛋白濃度，其余放入液氮中，-80℃冰箱(日本SANYO公司)保存?zhèn)溆?。使用前混勻?00℃變性5 min、分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗、二抗后采用HMIAS型高清晰度彩色分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術有限公司)分析，以目的蛋白灰度值/β-actin條帶灰度值計算海馬RAGE、NF-κBp65表達。

1.3統(tǒng)計學分析 使用SPSS19.0統(tǒng)計學應用軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DAU對AD小鼠學習記憶能力的影響 與對照組比較，模型組小鼠潛伏期明顯延長、游泳距離明顯增加、目標停留時間明顯縮短、跨平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組和DAU高、中劑量組小鼠潛伏期明顯縮短、游泳距離明顯減少、目標停留時間明顯延長和跨平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 DAU對AD小鼠學習記憶能力及海馬IL-1β、IL-6的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2DAU對AD小鼠海馬IL-1β、IL-6含量的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬IL-1β、IL-6含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組和DAU高、中劑量組均明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.3DAU對AD小鼠海馬RAGE、NF-κBp65表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬RAGE、NF-κBp65 MOD值明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組和DAU高、中劑量組均明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.4DAU對AD小鼠海馬RAGE、NF-κBp65 mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬RAGE、NF-κBp65 mRNA表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組和DAU高、中劑量組均明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.5DAU對AD小鼠海馬RAGE、NF-κBp65表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬RAGE、NF-κBp65表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組及DAU高、中劑量組均明顯降低(P<0.05)，見表2，見圖1。

表2 DAU對AD小鼠海馬RAGE、NF-κBp65 mRNA及蛋白表達的影響

1.對照組；2.模型組；3.多奈哌齊組；4.DAU高劑量組；5.DAU中劑量組；6.DAU低劑量組圖1 DAU對AD小鼠海馬RAGE、NF-κBp65表達的影響

3 討 論

AD的發(fā)病機制還不清楚，AD可出現(xiàn)Aβ在細胞外大量沉積形成SP及海馬RAGE、NF-κBp65表達異常等。目前國內(nèi)外多采用Aβ誘導模型〔20～23〕、D-半乳糖誘導模型〔24，25〕或轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型〔26～28〕等。本實驗結(jié)果顯示AD模型建立成功且DAU高、中劑量可改善AD小鼠學習記憶能力，可降低AD小鼠海馬炎癥介質(zhì)含量而減弱炎癥反應。

說明模型組中Aβ清除能力減弱，導致Aβ積聚，引發(fā)AD疾病；而DAU高、中劑量可通過增加RAGE和NF-κBp65表達量來實現(xiàn)其對AD的治療。另外本實驗說明模型組與Aβ轉(zhuǎn)運密切相關RAGE、NF-κBp65 mRNA和蛋白表達量增加，引起Aβ積聚，降低學習記憶能力及增加炎癥介質(zhì)水平而加重炎癥反應，引發(fā)AD疾?。欢鳧AU高、中劑量組海馬RAGE、NF-κBp65 mRNA和蛋白表達量降低，預示DAU高、中劑量可減少Aβ積聚，增強學習記憶能力及降低炎癥介質(zhì)水平而減弱炎癥反應，從而延緩AD病程，說明DAU高、中劑量對AD治療有效。由此顯示DAU高、中劑量可改善AD小鼠學習記憶能力和炎癥介質(zhì)水平，這與降低RAGE、NF-κBp65有一定關系。

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〔2017-01-15修回〕

(編輯 李相軍)

Theeffectsofdauricineonreceptorforadvancedglycationendproductsandnucleartranscriptionfactor-κBp65ofthehippocampusinAlzheimer'sdiseasemice

ZHANGYing-Bo，F(xiàn)EIHong-Xin，GUOJia，etal.

QiqiharMedicalUniversity，Qiqihaer161006，Heilongjiang，China

ObjectiveTo explore the effects of dauricine(DAU) on receptor for advanced glycation end products(RAGE) and nuclear transcription factor(NF)-κBp65 of the hippocampus in Alzheimer's disease(AD) mice.MethodsMale mice were randomly divided into control，model，donepezil (0.001 g/kg)，DAU high-dose (2.4 g/kg)，DAU medial-dose (1.2 g/kg)，DAU low-dose (0.6 g/kg) groups. The AD model mice were induced by microinjection of incubated amyloid beda1～42(2 g/L) into the dorsal blade of and intraperitoneal injection of D-galactose(180 mg/kg) in the dentale gyrus in the bilateral hippocampus. Morris water maze was used to observe the learning and memory ability of AD mice. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to determine the contents of IL-1β and IL-6. By immunohistochemistry(IHC)，real time (RT)-PCR and Western bolt were used to test the contents of RAGE and NF-κBp65 of the hippocampus in AD mice.ResultsCompared with those of model group，DAU high-dose and medial-dose significantly improved the learning and memory ability of AD mice(P<0.05). DAU high-dose and medial-dose decreased the levels of IL-1β，IL-6，RAGE and NF-κBp65 in the hippocampus(P<0.05).ConclusionsDAU could improve the ability of learning and memory of AD mice. DAU plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting RAGE and NF-κBp65.

Dauricine；Alzheimer's disease；Receptor for advanced glycation end products

R285

A

1005-9202(2017)19-4697-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.004

國家自然科學基金(81373777，81173599)；齊齊哈爾醫(yī)學院院內(nèi)科研博士專項基金(QY2016B-21，QY2016B-26)；黑龍江省教育廳科學研究項目(12531788)

1 黑龍江中醫(yī)藥大學

費洪新(1978-)，男，博士，講師，博士后，主要從事阿爾茨海默病、肝纖維化、腫瘤、痛風的實驗研究。

張英博(1973-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事阿爾茨海默病、肝纖維化、腫瘤、痛風的實驗研究。