尹 芳 鄭 靜 康湘萍 張麗娜 金國(guó)琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 201203)

·基礎(chǔ)研究·

老年大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因egr1表達(dá)變化的機(jī)制及補(bǔ)腎益氣方藥的調(diào)整作用

尹 芳 鄭 靜 康湘萍 張麗娜 金國(guó)琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 201203)

目的探討DNA甲基化老年大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因egr1表達(dá)變化的機(jī)制及補(bǔ)腎益氣方藥——左歸丸、益氣聰明湯的調(diào)整作用。方法以自然衰老(24月齡)SD雄性大鼠為動(dòng)物模型，隨機(jī)分為老年對(duì)照組、老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組，另設(shè)一組青年對(duì)照組(5月齡)。采用RT-PCR法及Western印跡法觀(guān)察大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因egr1 mRNA和蛋白表達(dá)變化，采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化結(jié)合高通量測(cè)序法檢測(cè)基因egr1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，同時(shí)觀(guān)察補(bǔ)腎益氣方藥對(duì)上述指標(biāo)變化的調(diào)整作用。結(jié)果與青年對(duì)照組相比，老年大鼠egr1 基因mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化增高，左歸丸、益氣聰明湯能不同程度地改善egr1的表達(dá)，并降低egr1啟動(dòng)子區(qū)甲基化率。結(jié)論補(bǔ)腎益氣方藥改善老年大鼠增齡性學(xué)習(xí)記憶退化可能與抑制基因egr1啟動(dòng)子DNA甲基化而提高egr1的表達(dá)有關(guān)。

egr1；DNA甲基化；左歸丸；益氣聰明湯

egr1是早期生長(zhǎng)反應(yīng)egr基因家族的一員，編碼的核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)突觸重塑和記憶以及長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)的誘導(dǎo)起到重要作用〔1〕。敲除egr1的小鼠海馬可觀(guān)察到短期LTP現(xiàn)象，且持續(xù)性L(fǎng)TP受損〔2〕；空間學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)中，egr1缺失的小鼠具有完整的短期記憶但長(zhǎng)期記憶缺失。Renaudineau等〔3〕研究表明，海馬中egr1是維持空間記憶長(zhǎng)期穩(wěn)定所必須的，而老年大鼠缺失這一過(guò)程〔4〕。目前，對(duì)增齡性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄變化的機(jī)制還不清楚，但有研究表明，突觸重塑和記憶形成過(guò)程中DNA甲基化與組蛋白乙酰化的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄〔5〕。越來(lái)越多的證據(jù)表明，老年大腦中的表觀(guān)遺傳變化影響增齡性相關(guān)的認(rèn)知功能〔6～8〕。例如，活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架基因(arc)是記憶相關(guān)基因，其轉(zhuǎn)錄因增齡而發(fā)生改變，這與arc基因的異常甲基化有關(guān)〔6〕。最近有研究發(fā)現(xiàn)，老年動(dòng)物海馬bdnf和egr1核小體組蛋白賴(lài)氨酸殘基甲基化水平異?！?〕。本實(shí)驗(yàn)在以往補(bǔ)腎益氣方藥改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶退化的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上〔9〕，著重觀(guān)察補(bǔ)腎益氣對(duì)大鼠海馬組織中egr1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響及egr1 DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)方藥 左歸丸出自《景岳全書(shū)》原方，由熟地黃20 g、山藥10 g、菟絲子10 g、枸杞子10 g、山茱萸10 g、牛膝7.5 g、龜板膠10 g、鹿角膠10 g組成；益氣聰明湯出自《東垣試效方·卷五》，由黃芪15 g、炙甘草15 g、人參15 g、升麻9 g、葛根9 g、蔓荊子4.5 g、芍藥3 g、黃柏3 g組成，以上藥物均購(gòu)自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。將各方藥按傳統(tǒng)方法水煎成劑，并加以濃縮，-30℃保存，臨用前稀釋?zhuān)缓蟿┮韵♂尯蟮淖髿w丸藥液與益氣聰明湯藥液等體積混合后飲用。

1.2試劑與儀器 Trizol(Invitrogen公司)，egr1兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam公司)，β-actin 兔抗大鼠多克隆抗體(CST公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(CST公司)，PrimeScriptTM RT Kit(TaKaRa公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Kit(TaKaRa公司)，Genomic DNA-issue MiniPrep(ZYMO公司)，DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO公司)，RU38486(Sigma公司)，引物合成(上海英濰捷基公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Milipore公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，RT-PCR儀(ABI公司)，蛋白電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(GBOX CHEMI)，測(cè)序(上海英濰捷基公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組 12月齡清潔級(jí)、雄性SD大鼠，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為老年對(duì)照組、老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組及老年拮抗組，另設(shè)青年對(duì)照組(5月齡)。自21月齡起，分別給老年補(bǔ)腎組、老年益氣組及老年合劑組大鼠飲用左歸丸、益氣聰明湯及兩方合劑藥液(劑量相當(dāng)于臨床成人每公斤體重劑量的9倍)，連續(xù)應(yīng)用3個(gè)月至24月齡，每周飲藥液5 d、停藥2 d；老年拮抗組于取樣前連續(xù)7 d皮下注射皮質(zhì)酮拮抗劑RU38486(5 mg/kg)〔10〕。

1.4方法

1.4.1egr1 mRNA表達(dá)檢測(cè) Trizol試劑提取大鼠海馬總RNA，測(cè)定OD260/OD280比值，瓊脂糖凝膠電泳判斷所提取RNA的純度和完整性；測(cè)定RNA濃度后分裝，-30℃保存待用。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA及RT-PCR反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用兩步法，熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ΔΔCt法分析。

1.4.2Western印跡法檢測(cè)egr1蛋白表達(dá) 分離大鼠海馬、提取蛋白，雙縮脲法定量蛋白，取上清液分裝，-80℃保存。依次進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及發(fā)光檢測(cè)，一抗的稀釋比例為1∶200，二抗的稀釋比例為1∶20 000，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色后凝膠成像分析系統(tǒng)直接成像、拍照，求得積分密度值(IOD)。

1.4.3高通量測(cè)序法檢測(cè)egr1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平 分離大鼠海馬、提取基因組DNA，組內(nèi)6個(gè)樣本的基因組DNA合并為1個(gè)樣本。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化，非甲基化狀態(tài)的胞嘧啶C被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，甲基化狀態(tài)的胞嘧啶C不會(huì)被轉(zhuǎn)化。UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)預(yù)測(cè)egr1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島，設(shè)計(jì)引物對(duì)egr1啟動(dòng)子區(qū)包含CpG島的一段DNA(該DNA片段包含5個(gè)CG位點(diǎn))進(jìn)行測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)腎益氣方藥對(duì)老年大鼠egr1 mRNA表達(dá)的影響 與青年對(duì)照組(0.991±0.011)比較，老年對(duì)照組大鼠海馬組織egr1基因mRNA表達(dá)(0.322±0.025)明顯降低(P<0.05)；與老年對(duì)照組相比，老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組(0.600±0.044、0.543±0.055、0.518±0.067、0.554±0.048)明顯升高(P<0.05)。

2.2補(bǔ)腎益氣方藥對(duì)老年大鼠egr1蛋白表達(dá)的影響 與青年對(duì)照組(0.516±0.024)比較，老年對(duì)照組大鼠海馬組織egr1蛋白表達(dá)(0.290±0.017)明顯降低(P<0.05)；與老年對(duì)照組相比，老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組(0.359±0.010、0.343±0.029、0.334±0.123)明顯升高(P<0.05)，老年拮抗組(0.303±0.016)有升高趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2補(bǔ)腎益氣方藥對(duì)老年大鼠egr1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平的影響 老年對(duì)照組大鼠海馬組織egr1基因啟動(dòng)子CpG島一段DNA平均甲基化率比青年對(duì)照組高，老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組比老年對(duì)照組低，老年拮抗組比老年對(duì)照組高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

從左至右：青年對(duì)照組、老年對(duì)照組、老年補(bǔ)腎組、老年益氣組、老年合劑組和老年拮抗組圖1 各組大鼠egr1 蛋白表達(dá)變化

組別位點(diǎn)1位點(diǎn)2位點(diǎn)3位點(diǎn)4位點(diǎn)5平均(x±s)青年對(duì)照組04.645.363.3502.67±2.54老年對(duì)照組2.164.355.473.523.343.77±1.23老年補(bǔ)腎組04.065.163.4302.53±2.39老年益氣組1.915.055.243.231.713.43±1.67老年合劑組03.665.192.9602.36±2.30老年拮抗組2.286.265.373.262.213.88±1.85

3 討 論

健康大鼠在其記憶形成和突觸重塑的認(rèn)知過(guò)程中需要即刻早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白(IEGs)，抑制這些基因的表達(dá)后認(rèn)知正常動(dòng)物的記憶也會(huì)受損，記憶相關(guān)疾病和正常衰老過(guò)程中伴隨IEG的異常表達(dá)〔11〕。DNA甲基化是調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因表達(dá)的機(jī)制，而衰老與大腦中特殊基因的甲基化修飾有關(guān)，其中包括egr1〔8〕。本研究中就單個(gè)CG位點(diǎn)甲基化率的檢測(cè)結(jié)果表明：第1、5位點(diǎn)在不同實(shí)驗(yàn)組中的甲基化率變化明顯，老年組的第3、4位點(diǎn)甲基化率最高，轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR預(yù)測(cè)顯示，位點(diǎn)1位于轉(zhuǎn)錄因子Pax-5的DNA結(jié)合序列中，位點(diǎn)5位于核轉(zhuǎn)錄因子NF-1的DNA結(jié)合序列中，位點(diǎn)3、4位于核轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3的DNA結(jié)合序列中，這些核轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。由此表明，CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)直接影響轉(zhuǎn)錄因子Pax-5、Sp1、Sp3、NF-1與啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合，進(jìn)而影響基因egr1轉(zhuǎn)錄乃至翻譯。

中醫(yī)認(rèn)為，老年性學(xué)習(xí)記憶的減退屬于“健忘”范疇，其病位在腦而本于腎。腎藏精生髓，腦為髓之海。腎強(qiáng)髓充則元神精湛而記憶不?。凰韬２蛔?，腦失充養(yǎng)，則神明呆滯而引起學(xué)習(xí)記憶功能減退甚至障礙。左歸丸出自明代《景岳全書(shū)·新八方陣》，是明代張仲景根據(jù)陰陽(yáng)互補(bǔ)原理研制的“滋補(bǔ)腎陰”的經(jīng)典補(bǔ)腎方藥，八藥合用，共湊滋陰補(bǔ)腎、填精益髓之功效。益氣聰明湯出自宋金時(shí)期著名醫(yī)家李杲所著的《東垣試效·方卷五》，“聰明”者，為視聽(tīng)靈敏，聰穎智慧之意，此方可使中氣得到補(bǔ)益，從而清陽(yáng)上升，肝腎受益，耳聰目明，神旺腦健。脾胃為“后天之本，氣血生化之源”，脾健氣足是健腦的重要條件，腎精的充盈賴(lài)于脾胃化生的水谷精微儒養(yǎng)。

脾腎相濟(jì)精足氣盛是神旺腦健的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了補(bǔ)腎益氣方藥改善老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能退化的分子機(jī)制可能與抑制DNA基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化修飾、提高學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因egr1 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

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〔2017-02-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

R28

A

1005-9202(2017)19-4689-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.001

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473583)

金國(guó)琴(1961-)，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥延緩衰老與預(yù)防老年病研究。

尹 芳(1986-)，女，在讀博士，主要從事中藥延緩衰老的研究。