劉 芳，董改英，瞿晶田，柴士偉（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300193）

蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度優(yōu)選及其對(duì)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響Δ

劉 芳＊，董改英，瞿晶田，柴士偉（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300193）

目的：優(yōu)選蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度，并研究其對(duì)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用柱前衍生化反相高效液相色譜法，以煎煮1次后4種主要氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的總煎出量為指標(biāo)，對(duì)蘄蛇飲片及過1～8號(hào)篩部分進(jìn)行篩選，優(yōu)選蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。將人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組（1 μmol/L甲氨蝶呤）和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組（2.0 mg/mL），分別作用48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號(hào)篩，此時(shí)4種主要氨基酸總煎出量為（61.27±0.02）mg/g（n＝3）。與陰性對(duì)照組比較，最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），且略高于陽性對(duì)照組。結(jié)論：蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號(hào)篩；蘄蛇煮散劑具有誘導(dǎo)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的作用。

蘄蛇；煮散劑；粉碎粒度；人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞；凋亡

蘄蛇為蝰科動(dòng)物五步蛇[Agkistrodon acutus（Güenther）]的干燥體，性甘，味咸，有毒，歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，常用于治療風(fēng)濕頑痹、麻木拘攣、中風(fēng)口眼?斜、半身不遂、搐痙攣、破傷風(fēng)、麻風(fēng)、疥癬等疾病[1]。蘄蛇是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，藥用資源短缺。因此，無論是從提高臨床療效，還是從節(jié)約資源的角度來講，對(duì)其進(jìn)行合理有效的利用都具有重要的意義。

中藥煮散劑是指將飲片粉碎成顆粒與水共同煎煮后，去渣取汁制成的液體劑型，是與傳統(tǒng)湯劑相同的一種用藥形式。采用煮散劑可以達(dá)到節(jié)約藥材、提高湯劑煎煮質(zhì)量等效果[2-3]。煮散劑的粉碎粒度影響著中藥有效成分的煎出量，有效成分的煎出量會(huì)隨著煮散劑粒度的變小呈現(xiàn)出先逐漸增高而后降低的趨勢(shì)。本研究擬在傳統(tǒng)中藥煮散理論的指導(dǎo)下，以煎煮1次（臨床常用煎煮方式）煎出的4種主要氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的總煎出量為指標(biāo)，對(duì)蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度進(jìn)行優(yōu)選。并在此基礎(chǔ)之上，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)，以細(xì)胞凋亡率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑誘導(dǎo)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的作用，初步揭示蘄蛇治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀、G1314B紫外-可見檢測(cè)器（美國安捷倫科技有限公司）；AL104電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CKX31倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；Dynex MrxⅡ酶標(biāo)儀（美國Dynex公司）；Dikma Diamonsil C18柱（中國迪馬科技有限公司，規(guī)格：150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑

注射用甲氨蝶呤（山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130531，規(guī)格：5 mg/支）；天冬氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140624-200805，純度：100%）、谷氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140624-200805，純度：99.5%）、L-羥脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)：111578-200201，純度：99.5%）、甘氨酸對(duì)照品（批號(hào)：140624-200805，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；MTT（美國Sigma公司，批號(hào)：9BT10330）；硫酸鏈霉素（華北制藥有限公司，批號(hào)：080902）；熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）凋亡試劑盒（美國基礎(chǔ)基因聯(lián)盟生物公司，批號(hào)：556547）；甲醇和乙腈為色譜純，異硫氰酸苯酯及其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

蘄蛇（河北美威藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：140201），經(jīng)我院王中華副主任藥師鑒定為真品。

1.4 滑膜組織

試驗(yàn)所需滑膜標(biāo)本取自2013年4月－2014年8月在我院確診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的6例住院患者（診斷標(biāo)準(zhǔn)符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)），其中女性5例、男性1例，年齡范圍為（58±6）歲，滑膜標(biāo)本經(jīng)手術(shù)病理標(biāo)本檢查證實(shí)。

2 方法

2.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離與鑒定

將無菌取出的滑膜組織漂洗后放在平皿中，盡量剪碎，放入離心管，加0.25%Ⅱ型膠原酶于恒溫振蕩器上連續(xù)消化3次，每次20 min。合并3次消化液后過6號(hào)金屬篩，收集細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于離心管中，以離心半徑為8 cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用含有雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL－1，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞鋪滿80%瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化、傳代。取細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察。

2.2 蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度的確定

取蘄蛇原藥材，粉碎。根據(jù)粉碎粒度的不同，將其分為飲片和過1～8號(hào)篩部分。分別精密稱取蘄蛇飲片或各過篩部分0.90 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加超純水50 mL，稱質(zhì)量，然后分別加熱回流提取1 h，放冷，再次稱質(zhì)量，用超純水補(bǔ)足減失的質(zhì)量。之后，參考文獻(xiàn)[4]方法，采用柱前衍生化反相高效液相色譜法分別測(cè)定各溶液中4種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的煎出量，以4種氨基酸的總煎出量為指標(biāo)，確定蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。

2.3 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑冷凍干燥物的制備 取最佳粉碎粒度篩蘄蛇煮散劑50.00 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱回流提取1 h，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收水溶液。濃縮物進(jìn)行冷凍干燥，得蘄蛇最佳粉碎煮散劑凍干粉5.77 g。

2.3.2 煮散劑凍干粉對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響考察 取3～5代生長(zhǎng)穩(wěn)定的成纖維樣滑膜細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105L－1，取4 mL細(xì)胞懸液復(fù)種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。將試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組。待培養(yǎng)瓶中成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)融合后（培養(yǎng)72 h），最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細(xì)胞加入4 mL的最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑冷凍干燥物（2.0 mg/mL）的DMEM/F12溶液；陽性對(duì)照組細(xì)胞加入1μmol/L甲氨蝶呤，陰性對(duì)照組細(xì)胞加入空白DMEM/F12溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用2.5 g/L的胰酶消化1 min左右，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，然后按AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作染色，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離鑒定結(jié)果

顯微鏡下可見，細(xì)胞呈梭狀成纖維樣，為人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞，結(jié)果見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果（×100）Fig 1 Morphology result of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes under inverted microscope（×100）

3.2 蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度的考察結(jié)果

蘄蛇飲片和不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑水煎煮1次后測(cè)定，結(jié)果過6號(hào)篩蘄蛇煮散劑中4種氨基酸的煎出量均最高，總煎出量為（61.27±0.02）mg/g，因此蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度為過6號(hào)篩，結(jié)果見表1。

3.3 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

表1 蘄蛇飲片及不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑4種氨基酸煎出量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，mg/g）Tab 1 Determination results of amounts of 4 amino acids in Agkistrodon decoction pieces and Agkistrodon decocting powderwith different crushing particle sizes（±s，n＝3，mg/g）

表1 蘄蛇飲片及不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑4種氨基酸煎出量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，mg/g）Tab 1 Determination results of amounts of 4 amino acids in Agkistrodon decoction pieces and Agkistrodon decocting powderwith different crushing particle sizes（±s，n＝3，mg/g）

粉碎度飲片過1號(hào)篩過2號(hào)篩過3號(hào)篩過4號(hào)篩過5號(hào)篩過6號(hào)篩過7號(hào)篩過8號(hào)篩天冬氨酸2.58±0.07 5.56±0.19 5.63±0.16 7.57±0.29 8.33±0.33 9.88±0.22 10.29±0.17 10.63±0.17 9.96±0.19谷氨酸5.27±0.12 9.72±0.26 10.02±0.24 13.42±0.43 14.97±0.63 16.75±0.33 18.23±0.33 18.66±0.36 17.34±0.31 L-羥脯氨酸1.73±0.01 6.17±0.26 5.67±0.02 7.34±0.02 8.03±0.13 8.30±0.22 8.76±0.14 8.37±0.08 6.43±0.08甘氨酸6.50±0.08 16.38±0.09 15.42±0.18 19.97±0.20 21.78±0.12 22.92±0.69 24.00±0.37 23.21±0.15 18.75±0.17總煎出量16.08±0.27 37.84±0.43 36.74±0.57 48.30±0.91 53.10±0.95 57.85±0.39 61.27±0.02 60.86±0.34 52.48±0.39

2.0 mg/mL蘄蛇煮散劑可促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡。與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細(xì)胞總凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細(xì)胞總凋亡率分別為（2.71±1.05）%、（23.29±1.85）%、（28.07±1.45）%（n＝3），流式圖見圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)定的流式圖Fig 2 Flow cytometry of apoptosis rate determination of cell in each group

4 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，蘄蛇具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[5-6]，能夠緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的癥狀，其作用機(jī)制可能與降低血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量和升高血清中白細(xì)胞介素10（IL-10）含量有關(guān)[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蘄蛇發(fā)揮作用的有效成分為Ⅱ型膠原蛋白類成分[8]?？紤]到蛋白類成分水解后為氨基酸，因此本研究以煎煮劑中4種主要氨基酸成分的總煎出量為指標(biāo)，參考阿膠中氨基酸的測(cè)定方法[9-10]——柱前衍生化法進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行了部分優(yōu)化，以確定蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。本研究結(jié)果顯示，粉碎粒度對(duì)蘄蛇多肽類物質(zhì)的煎出率具有明顯的影響，隨著粉碎粒度的逐漸變小，蘄蛇4種氨基酸的煎出量逐漸增加，達(dá)到最大值后又逐漸變小。當(dāng)蘄蛇煮散劑過6號(hào)篩后，4種總氨基酸的總煎出量達(dá)到最大，并且明顯高于傳統(tǒng)飲片。

本研究所用細(xì)胞為從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者身上提取的成纖維樣滑膜細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)比經(jīng)過改造的能穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞株更能反映細(xì)胞的實(shí)際病理狀態(tài)。筆者認(rèn)為，從患者身上取得的標(biāo)本，由于只進(jìn)行滑膜細(xì)胞的提取，故排除了其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。由于1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液最多能溶解2.00 mg蘄蛇煮散劑的冷凍干燥物，故本研究細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中蘄蛇煮散劑的最大質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL。本研究結(jié)果顯示，過6號(hào)的篩蘄蛇煮散劑（2.0 mg/mL）具有一定的誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞凋亡率為（28.07±1.45）%（n＝3）。

綜上所述，蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號(hào)篩。蘄蛇煮散劑在細(xì)胞模型基礎(chǔ)上具有一定的誘導(dǎo)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的作用，其在體內(nèi)是否具有相同的作用、作用強(qiáng)度如何，都需要應(yīng)用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Optimization of the Best Crushing Particle Size of Agkistrodon Decocting Powder and Its Effect on Apoptosis of Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes

LIU Fang，DONG Gaiying，QU Jingtian，CHAI Shiwei（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To optimize the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder，and study its effect on apoptosis of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.METHODS：Pre-column derivatization RP-HPLC was adopted.Using the total decoction amounts of 4 main amino acids（aspartic acid，glutamic acid，L-hydroxyproline，glycine）that decocted once as index，the Agkistrodon decoction pieces and those through No.1-8 seive were screened，and the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder was optimized.The human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes were divided into negative control group，positive control group（1 μmol/L methotrexate）and the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder group（2.0 mg/mL），flow cytometry was used to determine the cell apoptosis after cultured for 48 h.RESULTS：The best crushing particle size was through No.6 seive，when the total amount of 4 main amino acids was（61.27±0.02）mg/g（n＝3）.Compared with negative control group，the apoptosis rate in the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder group was significantly increased（P＜0.05），which was slightly higher than positive control group.CONCLUSIONS：The best crushing particle size is through No.6 seive；and Agkistrodon decocting powder shows effect on reducing the apoptosis of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.

Agkistrodon；Decocting powder；Crushing particle size；Human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes；Apoptosis

R932

A

1001-0408（2017）28-3935-03

2017-01-03

2017-06-29）

（編輯：林 靜）

天津市中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題（No.13060）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：中藥臨床藥學(xué)。電話：022-27987205。E-mail：tjcs008@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.13