李媛媛，姜艷玲，周洪雷*，張玲，蔡梅超，孫筱林，楚新紅

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.濟(jì)南三株醫(yī)藥生物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

響應(yīng)面法優(yōu)化鬼針草莖中總黃酮的提取工藝

李媛媛1，姜艷玲1，周洪雷1*，張玲1，蔡梅超1，孫筱林2，楚新紅2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.濟(jì)南三株醫(yī)藥生物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

本文以黃酮的提取率為指標(biāo)，考察乙醇濃度、用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)建立響應(yīng)面模型來優(yōu)選鬼針草莖中總黃酮的提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，鬼針草莖中總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比12∶1(mL/g)，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間1.5 h。在此條件下，總黃酮的提取率可達(dá)到0.95%，與理論值0.98%的相對(duì)誤差為3.06%。

鬼針草；總黃酮；提??；響應(yīng)面法

Abstract∶In this paper, the flavonoids extraction rate was taken as the index, the effects of ethanol concentration, dosage, extraction times and extraction time on the extraction results were investigated, and through Box-Behnken design, the response surface model was established to optimize the parameters of the technology for extracting total flavonoids from Bidens bipinnata L. stems. The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids fromBidensbipinnataL. stems. were as follows: the ethanol volume fraction was 70%, liquid-solid ratio was12∶1(mL/g), extracted 3 times, and the extraction time was 1.5 h. In these conditions, the maximum extraction rate of total flavonoids could reach 0.95%, and the relative error was 3.06% when compared with the theoretical value of 0.98%.

Key words∶BidensbipinnataL.; total flavonoids; extraction; the response surface methodology

鬼針草(BidensbipinnataL.)為菊科一年生草本植物，民間藥用歷史悠久，治療作用廣泛，藥材資源豐富[1]。鬼針草黃酮類物質(zhì)一直是研究的熱點(diǎn)，大量文獻(xiàn)表明[2-6]，黃酮具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及抗炎鎮(zhèn)痛等作用。目前對(duì)鬼針草的研究大多數(shù)是以全草為研究對(duì)象，對(duì)鬼針草不同藥用部位的研究相對(duì)較少，研究鬼針草不同藥用部位總黃酮的含量，對(duì)鬼針草總黃酮的提純應(yīng)用具有重要意義，本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)考察鬼針草莖中總黃酮的提取工藝。已有報(bào)道的鬼針草總黃酮的提取方法主要有超聲提取法和回流提取法[7-8]，超聲提取由于噪聲污染等問題應(yīng)用受到限制，回流提取是目前工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用較為廣泛的一種提取方法,對(duì)鬼針草總黃酮的乙醇回流提取工藝進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)選用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[9-10]，研究乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)鬼針草莖總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到鬼針草莖中總黃酮的最佳提取工藝,為鬼針草莖中總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1儀器

紫外分光光度計(jì)(U-2800，日本日立公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；MP10001電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；BS110S電子分析天平(德國塞多利斯公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海樹立儀器儀表有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2材料

鬼針草采于山東濟(jì)南，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為鬼針草(BidensbipinnataL.)；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：MUST-14102301，成都曼斯特生物技術(shù)有限公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等藥品試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1鬼針草莖中總黃酮的提取及測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲溶解，冷卻后用70%乙醇定容，得到對(duì)照品溶液(0.2 mg/mL)。

選用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色法，在509 nm處測(cè)定吸光度。其基本步驟如下：精密吸取對(duì)照品溶液6 mL，置于25 mL容量瓶中，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉試液1 mL，搖勻后放置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁試液1 mL，搖勻后放置6 min；最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉試液10 mL，加水至刻度，搖勻后放置15 min，測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度(A)對(duì)濃度(C)作回歸計(jì)算，得回歸方程A=10.731C-0.0136 (r=0.999 9)，總黃酮在0.019 738～0.061 68 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 方法學(xué)考察

2.1.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取蘆丁對(duì)照品溶液，于509 nm處測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算蘆丁相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.281%，表明儀器精密度好。

2.1.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取鬼針草莖2 g，6份，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品，測(cè)定，計(jì)算鬼針草莖中總黃酮的平均含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.399%，說明重復(fù)性良好。

2.1.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取蘆丁對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h內(nèi)測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.223%，對(duì)照品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，符合含量測(cè)定要求。

2.1.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取鬼針草莖樣品2 g，6份，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液5 mL，按2.1.1項(xiàng)下操作，測(cè)定平均回收率為98.81%，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%，說明本測(cè)定方法的回收率高，符合含量測(cè)定的要求。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化鬼針草莖中總黃酮的提取工藝

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

在液料比12∶1(mL/g)，回流提取3次，提取時(shí)間1 h的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響。

由圖1可知，選用80%乙醇作為提取溶劑提取鬼針草莖總黃酮比較合適。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)考察結(jié)果Fig.1 The content of flavonoids versus different ethanol volume fractions

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

在液料比12∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，回流提取3次的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。

由圖2可知，采用不同提取時(shí)間提取鬼針草莖中的總黃酮，1.5 h后隨著時(shí)間的延長黃酮含量基本穩(wěn)定，綜合考慮選擇提取時(shí)間為1.5 h適宜。

圖2 不同提取時(shí)間的考察結(jié)果Fig.2 The content of flavonoids versus different extraction time

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響

在液料比12∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間1.5 h的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響。

由圖3可知，黃酮含量隨著提取次數(shù)的增加而增加，提取3次后變化較為平坦，從節(jié)約成本和提高得率考慮，提取3次為宜。

圖3 不同提取次數(shù)的考察結(jié)果Fig.3 The content of flavonoids versus different extraction times

2.2.4 液料比對(duì)黃酮得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,回流提取3次，提取時(shí)間1.5 h的條件下，考察液料比對(duì)黃酮得率的影響。

由圖4可知，黃酮含量隨著乙醇用量的增加而增加，自液料比12∶1提取后，黃酮含量變化較為平坦，綜合成本等考慮，選擇液料比12∶1提取為宜。

圖4 不同液料比的考察結(jié)果Fig.4 The content of flavonoids versus different liquid-solid ratio

2.2.5 鬼針草莖總黃酮的響應(yīng)面分析結(jié)果

選擇提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比4個(gè)因素作為參考因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的因素與水平表

用Box-Behnken法設(shè)計(jì)得到的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 鬼針草莖黃酮提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

編號(hào)液料比乙醇體積分?jǐn)?shù)提取次數(shù)提取時(shí)間黃酮提取率/%2001100．352100-110．422200000．762301010．462410100．58250-1100．7426100-10．6227100-10．65

從表3可知，各影響因素對(duì)總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。其回歸方程為：Y=0.78+0.065A-0.15B+0.11C+0.075D-0.027AB-0.065AC+7.500E-003AD-0.055BC-0.070BD+0.093CD-0.11A2-0.18B2-0.16C2+7.917E-003D2。

響應(yīng)面對(duì)于單因素A、B、C、D構(gòu)成的三維空間圖，可以直觀地反映各因素之間的相互作用。通過Design-Expert.8.06軟件處理得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5～10。

表3 方差分析結(jié)果

圖5 液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)Fig.5 Liquid-solid ratio and ethanol volume fraction

圖6 液料比與提取次數(shù)Fig.6 Liquid-solid ratio and extraction times

圖7 液料比與提取時(shí)間Fig.7 Liquid-solid ratio and extraction time

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)Fig.8 Ethanol volume fraction and extraction times

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間Fig.9 Ethanol volume fraction and extraction time

圖10 提取次數(shù)與提取時(shí)間Fig.10 Extraction times and extraction time

由響應(yīng)曲面圖可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率基本上增加很少，同時(shí)，總黃酮提取率有明顯下降的趨勢(shì)；隨著液料比的增加，總黃酮提取率隨之增加，但當(dāng)液料比增大到一定程度后，其增加趨勢(shì)不明顯；隨著提取次數(shù)的增加，提取率也隨之增加，但提取次數(shù)增大到一定程度后，其增加趨勢(shì)亦不明顯；提取時(shí)間的變化對(duì)總黃酮提取率的影響相對(duì)于其他因素影響是最小的。由響應(yīng)面的陡峭程度可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對(duì)結(jié)果的影響非常顯著，其次是提取時(shí)間和液料比。由以上3D模型圖可知，在3個(gè)因素設(shè)定的范圍內(nèi)所呈現(xiàn)出來的響應(yīng)面不是傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)視覺的曲面圖，從系統(tǒng)給出的最佳提取條件可以得出，因素之間有較強(qiáng)的交互作用是導(dǎo)致此種現(xiàn)象的原因。根據(jù)所得到的模型，預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝條件為：液料比12.36∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)72.81%、提取次數(shù)2.67次、提取時(shí)間1.5 h，在此條件下黃酮的提取率理論上可達(dá)到0.98%。根據(jù)實(shí)際工作需要，最佳工藝條件調(diào)整為液料比12∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取3次、每次1.5 h。

此修正條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際得到的鬼針草莖總黃酮的平均提取率為0.95%，與理論值相比無顯著性差異(P>0.05)。因此，采用Box-Behnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的鬼針草莖總黃酮的提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

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Optimization of alcohol extraction techniques of total flavonoids fromBidensbipinnataL. stems using response surface methodology

LI Yuan-yuan1， JIANG Yan-ling1， ZHOU Hong-lei1*，ZHANG Ling1, CAI Mei-chao1， SUN Xiao-lin2, CHU Xin-hong2

(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2 Medical Institute of Sanzhu Co., Jinan 250100, China)

R284.2

A

1002-4026(2017)05-0021-07

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.004

2016-10-07

山東省科技計(jì)劃 (2013GSF11903)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HM080)；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(XTCX2014C01-03)

李媛媛(1992—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬镉行С煞值馁|(zhì)量控制。E-mail：1173406691@qq.com

*通信作者,周洪雷(1967—)，男，教授，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬镉行С煞值馁|(zhì)量控制研究。E-mail：zhouhongleitcm@163.com