徐玉玲, 謝 敏, 張 佳, 賀楨翔, 鐘林江, 劉 濤
(成都大學 藥學與生物工程學院, 四川 成都 610106)
川明參提取物質量標準的構建
徐玉玲, 謝 敏, 張 佳, 賀楨翔, 鐘林江, 劉 濤
(成都大學 藥學與生物工程學院, 四川 成都 610106)
為構建川明參提取物的質量標準,按照《中國藥典》2015年版及相關文獻方法分別建立川明參提取物性狀、薄層色譜鑒別、水分、灰分、熾灼殘渣、重金屬等項目的檢查方法并規(guī)定限度.以歐前胡素為指標,采用HPLC法測定川明參提取物中歐前胡素的含量.通過測定浸膏的吸濕性、流動性、堆密度等物理特性,從物理、化學角度全面控制川明參提取物的質量.結果顯示:供試品與對照品在相同位置處呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點,清晰可見,分離度好.川明參提取物的水分<9.0%,灰分<12.0%,熾灼殘渣<13.0%,歐前胡素含量>0.108%.川明參提取物的臨界相對濕度為52%,休止角不應超過59.0°,堆密度不應超過0.8 g/cm3.方法準確可靠,重復性好,可控性高,可操作性強,所建標準可用于川明參提取物的質量控制.
川明參提取物;高效液相色譜法;質量標準;物理性質;歐前胡素
川明參,別名明參、土明參等,為傘形科川明參屬植物川明參的干燥根[1],具有滋陰、健脾等功效,常用于脾虛食少、肺陰虛證等病癥的治療[2-4],其產(chǎn)區(qū)主要分布于四川金堂、蒼溪、巴中等地,作為可藥食兩用的藥材,川明參的市場需求量較大[5].川明參僅在2010年版《四川省中藥材標準》有簡單的外觀性狀描述,而《中國藥典》2015年版中尚未對其收載[6].目前,中藥及中藥提取物的質量標準多對其中的化學成分進行定性定量控制,但該方法可控性較差.此外,中藥提取物大都為藥品、保健食品或化妝品的中間體或原料藥,其理化性質對于其進一步開發(fā)利用有著較大的影響.本課題組前期已完成川明參提取物的制備工藝研究,為進一步控制其質量,本研究擬在相關技術要求和指導原則的基礎上,借鑒物理指紋圖譜的概念,研究并建立基于物理化學參數(shù)及化學成分的質量標準,擬為川明參提取物在生產(chǎn)應用中的質量控制提供依據(jù).
實驗所用儀器包括:P230II型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司),F(xiàn)A-2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司),BS-6KH型電子天平(上海友聲衡器有限公司),SX-2.5-10型馬弗爐、DZF-6050A型真空恒溫干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司),DZTW型電子調溫電熱套(天津市靜??h工興電器廠),酒精計(河北省武強縣同輝儀表廠).
實驗所用試藥包括:川明參,共3批,分別采收于四川省蒼溪縣龍山鎮(zhèn)、閬中市老觀鎮(zhèn)構溪鄉(xiāng)和閬中市千佛鎮(zhèn),經(jīng)成都大學劉濤研究員檢驗為傘形科植物川明參的干燥根;川明參提取物(批號,20160312、20160318、20160426、20160517、20160518、20160723、20161010、20170104、20170113、20170206),自制;歐前胡素對照品(批號,16070704,HPLC≥98%),四川省維克奇生物科技有限公司;銅(單元素標準溶液GSB 04-1725-2004)、汞(單元素標準溶液GSB 04-1729-2004)、砷(單元素標準溶液GSB 04-1714-2004)、鎘(單元素標準溶液GSB 04-1721-2004)、鉛(單元素標準溶液GSB 04-1742-2004);甲醇為色譜純,水為娃哈哈純凈水,其余試劑均為分析純.
稱取川明參藥材適量,加入6倍量60%乙醇,每次提取0.5 h,共3次,合并提取液,均勻混合后抽濾,取濾液并濃縮至密度約為1.1,制得浸膏,并將浸膏在80 ℃條件下減壓干燥.
測量結果表明,10批川明參提取物(批號為,20160312、20160318、20160426、20160517、20160518、20160723、20161010、20170104、20170113、20170206)的出膏率分別為,17.13%、14.32%、6.24%、6.08%、5.75%、15.32%、11.66%、16.32%、14.32%、10.38%.
取川明參提取物樣品,進行性狀觀察,并規(guī)定其性狀標準為:本品為均勻黃褐色粉末,氣芳香,味微苦.
2.3.1 臨界相對濕度測定.
選取川明參提取物(批號為,20170104、20170113、20170206),研磨成細粉,待用.分別稱取1 g左右的浸膏粉末,平鋪于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,稱重并干燥至恒重,備用.配制4種濃度不同的硫酸溶液,分別置干燥器中,密閉放置12 h,使其內(nèi)部環(huán)境濕度分別為48%、51%、55.4%、61.2%.將已恒重的樣品精密稱重后置于不同濕度環(huán)境的干燥器中,每個干燥器中放3份,放置48 h后,25 ℃恒溫吸濕至恒重,精密稱重并計算吸濕百分率計算公式見式(1),
(1)
以吸濕百分率為縱坐標,RH%為橫坐標作圖,結果如圖1、表1所示.
圖1吸濕百分率與相對濕度關系圖
繪制如圖1所示吸濕曲線兩端的切線,兩切線交點對應的橫坐標即為臨界相對濕度(critical relative humidity,CRH),由此測得此浸膏的CRH為52%.
表1 不同相對濕度條件下浸膏吸濕率
2.3.2 流動性(休止角)測定.
將3只漏斗串聯(lián)后固定于水平放置的坐標紙上的適宜高度處,將浸膏粉末緩緩地倒入最上面的漏斗中,直到最下面的漏斗形成的圓錐體粉末尖端接觸到漏斗下口為止,測出圓錐底部的直徑(2R)及漏斗下口距坐標紙的距離(H).根據(jù),α=tan-1(H/R),計算休止角α,其結果見表2.
表2 粉末休止角
結果表明,川明參提取物粉末的平均休止角為49.18 °,高于40 °,休止角較大,流動性較差.按照平均值的+20%規(guī)定其限度,規(guī)定本品休止角不得超過59.0 °.
2.3.3 堆密度測定.
取浸膏粉末適量,小心裝入10 cm3的量筒中,每隔2 s用玻璃棒輕輕擊打量筒5 cm處,共擊4次,直到裝滿10 cm3的量筒.根據(jù)量筒中樣品質量(W)除以量筒的容積,計算樣品的堆密度ρ.4批浸膏樣品的堆密度測定結果見表3.
表3 粉末堆密度
結果表明,川明參提取物粉末的平均堆密度為0.66 g/cm3.按照平均值的+20%規(guī)定其限度,規(guī)定本品堆密度不得超過0.8 g/cm3.
2.4.1 對照品溶液制備.
稱取歐前胡素適量,加甲醇制成每1 mL含0.24 mg歐前胡素的對照品溶液.
2.4.2 供試品溶液制備.
稱取川明參提取物(批號,20160312)約0.5 g,加入乙醚10 mL,超聲處理20 min,使之充分溶解,濾過,濾液揮干,加乙酸乙酯2mL溶解殘渣,制得供試品溶液.
2.4.3 川明參提取物的薄層色譜鑒別.
分別吸取供試品溶液及對照品溶液各6 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90 ℃)—乙醚(1∶5)為展開劑,待其展開,取出晾干,置于紫外光燈(365 nm)下檢視.結果顯示,供試品色譜中與歐前胡素對照品在相同位置處顯相同顏色的斑點(見圖2).
1、3為對照品溶液,2、4為供試品溶液
圖2川明參提取物薄層色譜圖
2.5.1 水 分.
取10批川明參提取物細粉適量,精密稱定,按照《中國藥典》2015年版四部的水分測定法進行測定,結果見表4.
表4 水分含量測定結果
根據(jù)檢測結果,所測樣品水分含量最高為7.88%,最低為6.37%,平均為7.69%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度,規(guī)定本品水分不得超過9.0%.
2.5.2 灰 分.
取6批川明參提取物細粉約2 g,精密稱定,按照《中國藥典》2015版四部的總灰分測定法進行測定,結果見表5.
根據(jù)檢測結果,所測樣品灰分含量最高為11.64%,最低為8.31%,平均為10.02%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度,規(guī)定本品灰分不得超過12.0%.
表5 灰分測定結果
2.5.3 熾灼殘渣.
取6批川明參提取物細粉約1.5 g,精密稱定,按照《中國藥典》2015年版四部的熾灼殘渣檢查法進行檢查,結果見表6.
表6 熾灼殘渣檢查結果
根據(jù)檢測結果,所測樣品熾灼殘渣含量最高為12.47%,最低為8.42%,平均為10.84%.按照平均值的+20%規(guī)定其限度,規(guī)定本品熾灼殘渣不得超過13.0%.
2.5.4 重金屬及有害元素.
取5批次川明參提取物細粉約1.5 g,精密稱定,按照《中國藥典》2015年版四部的鉛(Pb)、鎘(Cd)、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)測定法進行含量檢查,結果見表7.
表7 重金屬及有害元素檢查結果(mg·kg-1)
根據(jù)《中國藥典》2015年版的相關規(guī)定,規(guī)定本品鉛不超過5 mg/kg、鎘不超過0.3 mg/kg、銅不超過20 mg/kg、砷不超過2.0 mg/kg、汞不超過0.2 mg/kg.
2.6.1 色譜條件.
實驗色譜條件為:色譜柱為Global Chromatography C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇—水(62∶38);流速為1 mL·min-1;柱溫為20 ℃;進樣量為10 μL;檢測波長為246 nm.
2.6.2 對照品溶液制備.
稱取歐前胡素對照品適量,精密稱定,加甲醇25 mL,制成每毫升含0.24 mg歐前胡素的對照品溶液.精密移取0.24 mg/mL歐前胡素對照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度線,搖勻,制得48.00 μg/mL的對照品溶液.
2.6.3 供試品溶液制備.
稱取明參提取物粉末(60目)1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理30 min,冷卻至室溫,用甲醇補足損失的質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液5 mL于10 mL的容量瓶中,加入甲醇定容至刻度,微孔濾膜濾過,制得供試品溶液.
2.6.4 線性關系考察.
分別精密移取歐前胡素對照品溶液3、4、5、6、7 mL于10 mL容量瓶中并稀釋至刻度,搖勻.在“2.6.1”項色譜條件下測定歐前胡素峰面積,并以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得線性回歸方程,Y=3 622.8X+5.611(r=0.9997).結果表明,歐前胡素的進樣量在0.144~0.336 ug范圍內(nèi),峰面積與進樣量呈良好的線性關系.
2.6.5 精密度實驗.
精密吸取“2.6.2”項下對照品溶液,連續(xù)進樣6次,在“2.6.1”項色譜條件下測定,記錄峰面積,計算其RSD.結果顯示,RSD值為0.47%,表明儀器精密度良好.
2.6.6 重復性實驗.
取同一批次川明參提取物粉末(批號,20161010),平行6份,按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液,進行測定,記錄峰面積,計算其RSD.結果顯示,RSD值為1.99%,表明該方法重現(xiàn)性良好.
2.6.7 穩(wěn)定性實驗.
精密吸取同一供試品溶液,分別于 0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后進樣.結果顯示,RSD值為1.38%,表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.
2.6.8 加樣回收實驗.
精密稱取含有量已知的川明參提取物粉末(批號,20161010)共6份,每份0.5 g,各加入歐前胡素對照品溶液適量,按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.6.1”項色譜條件下進行測定,計算加樣回收率,結果見表8.結果顯示,RSD值為2.07%,表明回收率良好.
表8 歐前胡素加樣回收率實驗結果
2.6.9 樣品含量測定.
取10批川明參提取物,按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.6.1”項下色譜條件測定歐前胡素的峰面積,采用外標一點法計算出各批次提取物中歐前胡素的含量,結果如表9所示.
表9 各批次提取物含量測定
結果顯示,所測樣品中歐前胡素含量平均為0.135%.按照平均值的-20%規(guī)定其限度,規(guī)定川明參中歐前胡素的含量不低于0.108%.
川明參為我國特有的單種屬植物,但該藥材尚未收載入相關藥典標準,缺乏合適的質量控制方法.本課題組在完成川明參提取物制備工藝基礎上[8],以川明參提取物為研究對象,初步測定其物理化學性質.研究結果表明,采用物理參數(shù)控制提取物的質量,可更直觀全面地展現(xiàn)和控制提取物的質量.
中藥浸膏的物理性質是影響浸膏質量的重要因素,與固體制劑成型工藝密切相關.中藥浸膏的質量控制不應僅局限于指標成分的含量測定、定性鑒別、外觀性狀及檢查,還應加入堆密度、吸濕性、流動性等物理指標.本研究為了建立基于物理化學特性的川明參提取物質量控制標準和體系,對提取物的3個物理參數(shù),即吸濕性、流動性與堆密度進行了測定,從物理化學角度控制川明參提取物的質量.
研究發(fā)現(xiàn),川明參根部主要化學成分為多糖類、香豆素類及黃酮類等[9].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),川明參提取物中7-甲基香豆素含量過低,不能將其作為指標成分,而歐前胡素具有平喘、抗過敏等作用,性質較穩(wěn)定,具有較大的研究價值,故確定選擇以歐前胡素作為評價指標[10-11].
本研究按照確定的制備工藝,由3批不同產(chǎn)地的川明參藥材制備出了不同批次的川明參提取物,用于質量標準研究.基于充分的物理性質研究和定性、定量分析,建立了川明參提取物的質量控制方法和標準,涉及性狀、物理性質、薄層色譜鑒別以及含量測定.在薄層色譜鑒別方法考察過程中,分別選擇了氯仿—甲醇(2∶1)、二氯甲烷—甲醇(1∶1)、石油醚(60~90 ℃)—乙醚(3∶2)、以石油醚(60~90 ℃)∶乙醚(1∶5)等多種溶劑系統(tǒng)比較對歐前胡素的薄層展開效果.結果表明,以石油醚(60~90 ℃)—乙醚(1∶5)為展開劑,展開效果較好,斑點清晰可見、分離度好.采用HPLC法,以歐前胡素作為檢測指標,測定其含量并規(guī)定川明參提取物中歐前胡素含量不得低于0.108%.本研究所建立的質量標準可控性高,能全面有效地控制川明參提取物的質量,為川明參提取物的質量控制提供了可靠保障.
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Abstract:According to the “Chinese Phar-macopoeia” 2015 edition and based on the literature method,the quality standard of Chuanminshen violanceum extract is respectively established for its characters,TLC,physical properties,water content,ash content,residue on ignition,heavy metals,and other items.The corresponding limits are constituted.The imperatorin is used as an index,and the HPLC is applied to determine the contents of imperatorin for Chuanminshen violanceum extract.Through the test of the moisture obsorption performance,mobility and bulk density,etc.,of the extract,the quality of the extract is controlled completely from both physical and chemical perspective.The experimental results show that the sample extract and the contrast extract take on fluorescent spots of the same color and have good resolution which can be clearly seen at the same position.CRH of Chuanminshen violanceum extract is 52%,angle of repose is no more than 59.0°,bulk density is no more than 0.8 g/cm3,water<9.0%,ash<12.0%,residue on ignition <13.0%,imperatorin is <0.108%.It is thus demonstrated that the methods are accurate and reliable,with strong repeatability,controllability,operability,so that it can be used for the study of the quality standard of Chuanminshenviolanceum extract.
Keywords:Chuanminshen violaceum extract;HPLC;quality standard;physical property;imperatorin
ConstructionofQualityStandardofChuanminshenViolanceumExtract
XUYuling,XIEMin,ZHANGJia,HEZhenxiang,ZHONGLinjiang,LIUTao
(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)
1004-5422(2017)03-0230-05
2017-06-01.
四川省千人計劃(2013332)資助項目.
徐玉玲(1975 — ), 女, 碩士, 高級工程師, 從事中藥制劑開發(fā)與中成藥質量再評價研究.
R284.2
A
文章編號:1004-5422(2017)03-0235-04