彭瀟，方世記，鄭麗云，邱偉文

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 介入科，浙江 麗水 323000；3.溫州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

丹酚酸A對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的保護作用及其機制

彭瀟1，方世記2，鄭麗云1，邱偉文3

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 介入科，浙江 麗水 323000；3.溫州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

目的：探討丹酚酸A（Sal A）對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的保護作用及其機制。方法：采用線拴法構(gòu)建大腦中動脈缺血再灌注（MCA-IR）模型。將正常SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（對照組）、MCA-IR模型組（MCA-IR組)、Sal A+MCA-IR組（Sal A組）；Sal A組于建模前1周每日腹腔注射1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A。于再灌注后24 h取梗死腦組織用TUNEL法檢測腦細胞凋亡，Western blot檢測磷酸化Akt（p-Akt）和Akt的表達，免疫組織化學法檢測海馬區(qū)胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）的表達。結(jié)果：Sal A組海馬CA1區(qū)細胞凋亡率和MDA含量較MCA-IR組降低，而SOD量較MCA-IR組顯著增加（P＜0.05），MCA-IR組海馬區(qū)p-Akt表達較對照組顯著下降（P＜0.05），而cPLA2較對照組顯著增高（P＜0.05），1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A預(yù)處理后，MCA-IR模型大鼠海馬區(qū)cPLA2表達顯著降低（P＜0.05），而p-Akt表達顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論：Sal A降低缺血再灌注損傷后細胞凋亡，起到損傷保護作用，其機制與其降低cPLA2表達，激活A(yù)kt信號通路有關(guān)。

丹酚酸A；細胞凋亡；蛋白激酶B；腦缺血再灌注；大鼠

Abstract: Objective:To investigate the protective effect of salvianolic acid A (Sal A) against apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion model and its mechanism.Methods:SD rats were randomly divided into sham operation group (sham group), middle cerebral artery ischemia reperfusion model (MCA-IR) group (MCA-IR group), Sal A pretreatment and MCA-IR group (Sal A+MCA-IR group). MCA-IR was established in MCA-IR group and Sal A+MCA-IR group in which rats were pre-treated with 1.0, 2.5, 5.0 mg/kg Sal A via intraperitoneal injection daily for 1 week. The artery were reperfused for 24 h and rats were sacrificed. TUNEL was used to assayed the cell apoptosis, immunohistochemistry was implied to test the expression of cPLA2 and Western blot was undergone to analyzed p-Akt and total Akt. Immunohistochemistry was used to analyze the expression of cPLA2.Results:The apoptosis rate and MDA level in Sal A+MCA-IR group was lower, but SOD was higher than that in MCA-IR group (P＜0.05). The expression of p-Akt in Hippocampus of MCA-IR model decreased, while the expression of cPLA2 increased significantly compared with control group. 1.0, 2.5, 5.0 mg/kg Sal A pretreatment reversed the decrease of p-Akt and increase of cPLA2.Conclusion:Sal A inhibits the apoptosis through decreasing the expression of cPLA2 and activating Akt pathway signaling in MCA-IR model.

Key words:salvianolic acid A; apoptosis; protein kinase B; ischemia-reperfusion; rats

腦缺血再灌注引起的細胞凋亡和氧自由基的釋放是腦缺血嚴重臨床癥狀的主要原因[1-2]。研究證實胞漿型磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2，cPLA2）通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)分子的代謝，參與腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細胞凋亡[3-4]。丹酚酸A（sal-vianolic acid A，Sal A）是丹參藥物重要提取成分之一，是一種氧自由基清除劑，對氧化應(yīng)激引起的細胞損傷具有保護作用[5-6]。但Sal A對腦缺血再灌注過程細胞凋亡的影響及其機制仍未明確。因此，本研究采用大腦中動脈缺血再灌注（middle cerebral artery ischemia reperfusion，MCA-IR）模型，研究Sal A對MCA-IR模型海馬區(qū)細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：Sal A購買于美國Sigma公司，TUNEL凋亡試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p-Akt、Akt、β-Actin單克隆抗體購買于美國CST公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.1.2 實驗動物及分組：雄性SD大鼠25只，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2015-0009，體質(zhì)量（200±20）g。隨機分為3組：假手術(shù)組（對照組）5只，MCA-IR模型組（模型組）5只，Sal A+MCA-IR組（Sal A組）各15只。Sal A組又隨機分為3組，每組5只，于建模前1周分別每日腹腔注射1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A，模型組和對照組于建模前給予等量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 MCA-IR模型建立：按照文獻[7]方法，采用線栓法制作MCA-IR模型，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定，取正中切口，分離左頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，插入涂有肝素的尼龍線栓（直徑為0.25 mm），沿頸內(nèi)動脈入顱至大腦前動脈起始處、阻斷大腦中動脈。術(shù)后大鼠蘇醒時出現(xiàn)右前肢屈曲和前進時（右側(cè)劃圈狀），證明左側(cè)大腦中動脈阻塞成功。線栓插入深度為（20.0±0.5）mm，扎緊備線，縫合皮膚。缺血2 h后輕提預(yù)留線頭，使線栓頭端退至切口。大腦中動脈繼續(xù)從Willis環(huán)獲得血供即為再灌注。對照組僅插入栓子15 mm，其余步驟同上。

1.2.2 大腦標本收集：模型組、Sal A組中大鼠于再灌注24 h用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，立即置于無菌冰臺上斷頭處死；對照組假處理后，迅速開顱取腦組織，將一半腦組織置于PBS溶液中，再用液氮迅速冷凍保存用于Western blot方法檢測p-Akt/Akt表達及生化指標檢測；另一半腦組織則置于4%中性甲醛溶液中固定，24 h后石蠟包埋、切片、備用。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡：腦片常規(guī)脫蠟處理后，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，37 ℃下作用15 min，PBS洗滌3次；再用0.3%甲醇-過氧化氫溶液室溫孵育20 min，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用PBS洗滌3次，按照說明書方法配制TUNEL檢測液，在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.1～0.3 mL標記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；用50 μL Streptavidin-HRP工作液和0.2～0.5 mL DAB顯色液進行樣品顯色。蘇木精復(fù)染，脫水、透明和封固，光鏡下觀察細胞凋亡，并統(tǒng)計TUNEL陽性細胞數(shù)量。

1.2.4 免疫組織化學檢測腦組織cPLA2：腦片常規(guī)脫蠟處理后，置于0.3%甲醇-過氧化氫溶液中滅活內(nèi)源性過氧化酶，用0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)。10%山羊血清37 ℃濕盒內(nèi)孵育30 min。加cPLA2一抗抗體（1∶500），4 ℃過夜。PBS漂洗2次，加入二抗抗體（抗鼠l∶500），濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h。PBS漂洗2次，加入DAB顯色液避光顯色15 min，流水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精對比染色、脫水、透明、封固、光鏡觀察，陽性反應(yīng)為細胞質(zhì)呈棕黃色，并統(tǒng)計每個樣本單個視野下TUNEL陽性細胞數(shù)，取3個或3個以上視野，求平均值。

1.2.5 生化指標檢測：按照文獻[8]方法，將腦組織用0.9%氯化鈉溶液制成質(zhì)量體積比為1∶9勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書測定腦組織中SOD、MDA，計算出MDA和SOD的含量。

1.2.6 Western blot法檢測p-Akt/Akt表達：將腦組織均勻勻漿后，隨后加入組織裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清。采用BAC法進行蛋白定量。取20 μg總蛋白用4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜，隨后PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，加入HRP標記的二抗室溫孵育1～2 h，再用PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，以對照組為參照，計算p-Akt/Akt相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以 ±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Sal A抑制大鼠缺血再灌注模型中腦組織細胞凋亡 模型組海馬CA l區(qū)TUNEL陽性細胞百分比和MDA含量較對照組明顯增高（P＜0.05），而SOD較對照組明顯降低（P＜0.05）；Sal A組海馬CA l區(qū)凋亡細胞百分比和MDA含量較模型組明顯降低（P＜0.05），而SOD含量較模型組明顯增高（P＜0.05）。見表1。

2.2 Sal A抑制大鼠缺血再灌注腦組織中cPLA2表達 對照組大腦切片可見少許cPLA2表達，模型組與對照組比，腦切片中海馬CA 1區(qū)cPLA2表達量明顯增高（P＜0.05）；1.0、2.5、 5.0 mg/kg Sal A組大腦切片中海馬CA 1區(qū)cPLA2表達量均較模型組明顯降低（P＜0.05），但仍高于對照組。見表2。

表1 各組腦組織TUNEL陽性細胞數(shù)、MDA和SOD含量比較（n=5， ±s）

表2 各組海馬CA 1區(qū)cPLA2表達量的比較（n=5， ±s）

2.3 p-Akt在Sal A治療缺血再灌注腦組織中的表達 對照組海馬CA 1區(qū)中p-Akt有表達，模型組海馬CA 1區(qū)p-Akt相對表達量較對照組明顯降低（P＜0.05），1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A組海馬CA 1區(qū)p-Akt相對表達量較模型組明顯增高（P＜0.05）。見圖1。

3 討論

丹酚酸為唇型科植物丹參的干燥根及根莖的提取物，在臨床上應(yīng)用廣泛，可用于治療心腦血管疾病等缺血缺氧性疾病，其主要活性成分包括丹酚酸和丹參酮兩大類[5-6，9]。研究證實總丹酚酸和丹參酮類活性物質(zhì)可顯著降低心肌缺血再灌注損傷過程中的細胞凋亡[9]，也有研究證實丹酚酸B抑制了缺血再灌注導(dǎo)致的海馬區(qū)組織損傷，減少細胞凋亡，而減少海馬區(qū)神經(jīng)元丟失[10]。但是Sal A對腦缺血再灌注損傷的保護作用仍鮮有相關(guān)報道，因此，本研究重點分析Sal A對腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響，闡明其可能的分子機制，為臨床應(yīng)用Sal A治療缺血性再灌注損傷性疾病提供循證醫(yī)學根據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sal A預(yù)處理1周，可顯著減少MCA-IR模型SD大鼠海馬區(qū)細胞凋亡，降低MDA含量，增加SOD含量，對腦組織細胞具有保護作用。

圖1 各組p-Akt/Akt的相對表達量比較

cPLA2能將膜甘油水解成花生四烯酸和溶血磷脂酶，具有廣泛的生物活性，在缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注時，cPLA2增加，促使血腦屏障功能紊亂[11]。有研究認為，缺血再灌注損傷過程中，增高的cPLA2參與細胞凋亡，阻斷或敲低cPLA2表達，可顯著降低細胞的凋亡[12]。本研究亦證實大鼠MCA-IR模型海馬區(qū)cPLA2表達增加，而Sal A可顯著降低cPLA2的表達水平，提示Sal A降低海馬區(qū)細胞凋亡可能與抑制cPLA2表達有關(guān)。

Akt是細胞內(nèi)重要蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等功能[13-14]。已有研究證實Sal A通過激活A(yù)kt信號通路，抑制細胞凋亡[5-6，14]。本研究結(jié)果亦證實，MCA-IR模型腦組織Akt活化水平較對照組顯著降低，而Sal A預(yù)處理后，MCA-IR模型海馬區(qū)Akt活化水平顯著提高，提示Akt作為細胞內(nèi)重要信號分子，在Sal A保護海馬區(qū)缺血再灌注損傷中扮演重要角色。

本研究相關(guān)結(jié)果作為初步研究結(jié)果證實了Sal A作為丹酚酸的重要活性成分，抑制缺血再灌注損傷過程中海馬區(qū)細胞凋亡作用，具有保護作用，其具體分子機制可能與抑制cPLA2表達，激活A(yù)kt信號通路有關(guān)；但其分子機制仍需進一步證實。我們將通過藥物阻斷或者基因敲除的方法，進一步分析cPLA2和Akt信號通路在Sal A抑制缺血再灌注損傷過程中細胞凋亡的作用，并明確Akt和cPLA2兩者之間的相互關(guān)系，最終明確Sal A抑制缺血再灌注損傷腦細胞凋亡的分子機制。

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（本文編輯：趙翠翠）

The protective effect of salvianolic acid A against apoptosis in middle cerebral artery ischemia reperfusion model and its mechanism

PENG Xiao1, FANG Shiji2, ZHENG Liyun1, QIU Weiwen3. 1.Department of Neu-rology, the Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000; 2.Department of Intervention, the Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000; 3.Department of Neurology, the Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000

R285；R743.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.010

2017-01-15

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2017KY170）；麗水市公益性技術(shù)應(yīng)用項目（2016GYX39、2016GYX25）。

彭瀟（1983-），男，浙江麗水人，主治醫(yī)師。

邱偉文，主任醫(yī)師，Email：weiwenq@hotmail.com。