羅春芬，黎勝苗，潘志文，許嘉川，劉征吉，於林軍

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 小兒外科，浙江 臺(tái)州 317000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物研究所，浙江 杭州 310058）

散發(fā)性先天性巨結(jié)腸與SOX10基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性

羅春芬1，黎勝苗1，潘志文2，許嘉川1，劉征吉1，於林軍1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 小兒外科，浙江 臺(tái)州 317000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物研究所，浙江 杭州 310058）

目的：探討先天性巨結(jié)腸（HD）患者SOX10基因多態(tài)性與HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法：收集散發(fā)性HD患者外周血標(biāo)本95例為病例組，同時(shí)選取健康無(wú)便秘史患者80例作為對(duì)照組。提取外周血DNA，采用PCR和直接測(cè)序法分析SOX10基因多態(tài)性在病例組和對(duì)照組的分布情況。結(jié)果：直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)SOX10基因有4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），這些位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，關(guān)聯(lián)分析未發(fā)現(xiàn)SOX10基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)與HD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。結(jié)論：SOX10基因的4個(gè)SNPs位點(diǎn)與散發(fā)HD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著相關(guān)性，SOX10基因可能不是散發(fā)性HD患者的易感基因。

SOX10基因；先天性巨結(jié)腸；多態(tài)性，單核苷酸

Abstract: Objective:To determine the association between the variations ofSOX10gene and sporadic HD in Zhejiang province.Methods:Blood from 95 sporadic HD cases and 80 normal cases were collected. Direct sequencing and polymerase chain reaction amplification were used to analyze 4 exons of theSOX10gene for mutations and polymorphisms.Results:In this study, 4 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified. NoSOX10gene mutations was found with sporadic HD.Conclusion:There is no association between these 4 SNPs of theSOX10gene and HD. TheSOX10gene may not be the susceptibility gene of HD.

Key words:SOX10gene; hirschsprung disease; polymorphism, single nucleotide

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung disease，HD）又稱(chēng)無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸（aganglionar megacolon）或腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥（aganglionosis），是小兒常見(jiàn)的先天性消化道畸形，主要組織病理改變?yōu)椴∽兌文c管黏膜下層和肌層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，造成該段腸管呈持續(xù)性痙攣狀態(tài)，導(dǎo)致近端腸管代償性擴(kuò)張，從而出現(xiàn)便秘、腸梗阻、小腸結(jié)腸炎等一系列消化道癥狀，發(fā)病率約為1/5 000[1]。其發(fā)病與遺傳因素有關(guān)，一些與腸神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的基因突變可導(dǎo)致HD發(fā)生。RET基因是主要的易感基因，由RET編碼區(qū)突變引起的HD占家族性HD的50%和散發(fā)性HD的7%～35%；其他基因如EDNRB、EDN3等也與HD發(fā)病相關(guān)，是HD的易感基因[2-3]。

SOX10基因位于染色體22q13，編碼466個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[4]，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴源性細(xì)胞包括黑色素細(xì)胞和腸神經(jīng)細(xì)胞的正常發(fā)育[5]。Shah-Waardenburg綜合征（WS4）患者中有SOX10基因雜合突變檢出，患者除了有HD的癥狀，還表現(xiàn)為色素缺陷、耳聾等。迄今已發(fā)現(xiàn)有多例綜合征型HD病例中檢測(cè)出有攜帶SOX10基因突變[6-10]，但SOX10基因與散發(fā)性HD的相關(guān)性研究較少。本研究通過(guò)對(duì)照分析浙江省散發(fā)性HD病例和正常人群的SOX10基因多態(tài)性，探討SOX10基因是否與散發(fā)性HD的發(fā)病相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣收集：收集2011年至2015年間經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院臨床和病理確診的95例散發(fā)性HD患兒血樣為病例組，其中男71例，女24例，年齡2個(gè)月～13歲，漢族，按Rome分型標(biāo)準(zhǔn)[11]分為：短段型36例，常見(jiàn)型28例，長(zhǎng)段型24例，全結(jié)腸型7例。所有病例直系親屬無(wú)HD患者，無(wú)其他合并癥。收集同期健康兒童80例血樣為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.1.2 PCR引物序列：根據(jù)SOX10基因的外顯子使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 SOX10基因4個(gè)外顯子引物序列

1.2 方法 取病例組和對(duì)照組外周血2 mL，根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA抽提。PCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min，以94 ℃ 1 min，56～62 ℃（第1外顯子56 ℃，第2外顯子62 ℃，第3外顯子58 ℃，第4外顯子56 ℃）30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。測(cè)序之前，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化所有引物，C18柱回收。應(yīng)用ABI3000自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行突變篩查。所有目的基因的測(cè)序結(jié)果重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。運(yùn)用邏輯回歸方法，在顯性、共顯性、超顯性、隱性、加性五種不同遺傳模式下分析單個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）和HD是否相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段后測(cè)序，與基因庫(kù)SOX10序列比對(duì)，結(jié)果在SOX10基因上發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs（見(jiàn)圖1）。SNP1在第2外顯子編碼區(qū)，基因序列改變?yōu)镚AC→GAT；SNP2位于第2外顯子編碼區(qū)，基因序列改變?yōu)镚GC→GTC，引起第41位甘氨酸變?yōu)槔i氨酸；SNP3位于第2內(nèi)含子區(qū)域，基因序列改變?yōu)镃＞G；SNP4位于第4外顯子編碼區(qū)，基因序列改變?yōu)镃AT→CAC，是第309位組氨酸的同義突變。

在對(duì)照組中，4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P值分別為0.39、0.96、0.82、0.39）?；蛐头植己?個(gè)SNP的等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為1.15、0.19、0.38、0.12，P分別為0.28、0.67、0.54、0.73），見(jiàn)表2。

3 討論

HD發(fā)病率約為1/5 000，占先天性消化道畸形疾病的第2位，以腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移障礙導(dǎo)致腸道局部神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失為主要病理特征，臨床上表現(xiàn)為便秘、腸梗阻、小腸結(jié)腸炎等消化道癥狀，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量及生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重者甚至危及生命[12]。近年來(lái)，HD的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，HD是由遺傳、腸壁內(nèi)微環(huán)境改變、環(huán)境等多因素共同作用引起的，而遺傳因素最為重要。RET基因及其配體GDNF、NTN，EDNRB基因及其配體EDN3，BMP信號(hào)通路，KBP，L1CAM黏附分子，KIAA1279，轉(zhuǎn)錄因子PHOX2B、SOX10、MASH1、HAND2和ZFHX1B等在HD發(fā)病中起重要作用[13-14]，它們的異常引起信號(hào)傳導(dǎo)的異常，從而進(jìn)一步影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化、增殖以及移行，最后導(dǎo)致HD的發(fā)生[15-16]。近年來(lái)，有關(guān)SOX10基因的研究逐漸增多，但未發(fā)現(xiàn)相關(guān)突變熱點(diǎn)，僅對(duì)合并有HD相關(guān)綜合征如WS4（Shah-Waardenburg syndrome，OMIM 277580）及PCWH（peripheral demyelinating neuropathy，central dysmyelinating leukodystrophy，WS，and HD，OMIM 609136）等患者有較多的報(bào)道，而對(duì)HD患者的研究鮮有報(bào)道[6-10]。

SOX10基因位于染色體22q13，屬于SOX基因家族成員。SOX基因家族編碼一系列SOX家族轉(zhuǎn)錄因子，主要特征是含有一個(gè)高度保守的HMG-box DNA結(jié)合域，參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的調(diào)控[17-18]。SOX10基因編碼466個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)多能神經(jīng)嵴細(xì)胞的基因表達(dá)，在神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖、遷移、分化及發(fā)育等過(guò)程中起著非常重要的作用[5，8，19-20]。PINGAULT等[21]在1998年首先報(bào)道了WS4患者存在SOX10基因的突變。2010年，SáNCHEZMEJíAS等[10]報(bào)道在西班牙HD人群中發(fā)現(xiàn)了SOX10缺失（c.153-155del），并且認(rèn)為在HMG結(jié)構(gòu)域上游的SOX10的缺失在功能上等同于無(wú)效突變。本研究選取散發(fā)性HD患兒及健康兒童進(jìn)行病例對(duì)照研究，未發(fā)現(xiàn)SOX10相關(guān)位點(diǎn)的突變與HD發(fā)病相關(guān)，表明SOX10不是散發(fā)性HD患者發(fā)病的主要原因。然而，我們?cè)赟OX10基因中檢測(cè)了4個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP1檢測(cè)結(jié)果與SáNCHEZ-MEJíAS等[10]的報(bào)道一致，不改變氨基酸編碼序列；SNP2是本研究新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，使得編碼的氨基酸從甘氨酸變?yōu)槔i氨酸，突變位點(diǎn)位于SOX10 HMG保守區(qū)域上游，且無(wú)一例患者具有WS4、PCWH等其他相關(guān)臨床表現(xiàn)，此多態(tài)性位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，其多態(tài)性引起的氨基酸序列對(duì)SOX蛋白功能的影響仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究；SNP3是內(nèi)含子多態(tài)性位點(diǎn)；SNP4在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中序號(hào)是rSl39884，該位點(diǎn)是一個(gè)同義突變點(diǎn)，編碼氨基酸為組氨酸。在4個(gè)位點(diǎn)的分析中，盡管正常對(duì)照組符合Hardy-Weinberg平衡，但分析顯示4個(gè)SNP位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中分布無(wú)顯著性差異，表明這4個(gè)SNP位點(diǎn)與HD的發(fā)病不存在相關(guān)性。由4個(gè)SNP位點(diǎn)組成的單體型在HD病例組和正常組中的分布也未見(jiàn)顯著性差異，這些單體型與HD發(fā)病不具有相關(guān)性。以上研究結(jié)果表明，SOX10基因可能不是HD發(fā)病的易感基因。

圖1 SOX10基因測(cè)序結(jié)果

表2 SOX10基因4個(gè)SNP位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組的頻率分布（%）

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（本文編輯：丁敏嬌）

Association analysis of theSOX10polymorphism and Hirschsprung

LUO Chunfen1, LI Shengmiao1, PANZhiwen2, XU Jiachuan1, LIU Zhengji1, YU Linjun1. 1.Department of Pediatric Surgery, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Taizhou, 317000; 2.Institute of Cell Biology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, 310058

R726.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.008

2016-12-26

臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（121ky08）。

羅春芬（1962-），女，浙江臺(tái)州人，主任醫(yī)師。

於林軍，副主任醫(yī)師，Email：yulj@enzemed.com。