謝月群，王蕾，陳玲瓏，徐穎，楊之濤，盧中秋

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 急診科，上海 200025；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州325015）

PARP-1蛋白抑制劑降低TNF-α介導(dǎo)的人心肌細(xì)胞生長抑制和凋亡

謝月群1，王蕾1，陳玲瓏1，徐穎1，楊之濤2，盧中秋3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 急診科，上海 200025；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州325015）

目的：研究PARP-1蛋白抑制劑對由腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導(dǎo)的人心肌細(xì)胞生長抑制和凋亡的干預(yù)作用。方法：MTT比色法檢測TNF-α抑制人心肌細(xì)胞HCM細(xì)胞株生長的IC50濃度，以及PARP-1蛋白抑制劑干預(yù)對HCM細(xì)胞生長抑制率的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測TNF-α和PARP-1蛋白抑制劑對HCM細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比率的影響；RT-PCR和Western blot分析PARP-1蛋白抑制劑干預(yù)對PARP-1基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)影響。結(jié)果：TNF-α對HCM細(xì)胞具有明顯細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，并且上調(diào)PARP-1基因mRNA水平，促進(jìn)PARP-1蛋白裂解（P＜0.05）；PARP-1蛋白抑制劑干預(yù)后，TNF-α對HCM細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用均減弱（P＜0.05），PARP-1基因表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），PARP-1蛋白和其裂解產(chǎn)物與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：通過PARP-1蛋白抑制劑阻斷PARP-1蛋白活性和基因的轉(zhuǎn)錄水平可以減弱TNF-α對HCM的細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。

腫瘤壞死因子α；肌細(xì)胞，心臟；PARP-1蛋白抑制劑；細(xì)胞凋亡

Abstract: Objective:To study the effect of PARP-1 inhibitor (4-Aminonaphthalimide) on the apoptosis of human cardiomyocytes mediated by TNF-α.Methods:MTT assays were used to detect the IC50concentration of TNF-α on human cardiomyocytes cell line HCM, this assays were also performed to analyze the effect of the treatment with IC50concentration of TNF-α combined with different concentration of PARP-1 inhibitor on proliferation of the HCM cells. Flow cytometry was used to monitor the apoptosis of HCM cells treated with different concentrations of TNF-α with or without PARP-1 inhibitors; RT-PCR and Western blot were used to analyze the expression level of PARP-1 in HCM cells after treated with different concentration of TNF-α with or without PARP-1 inhibitor.Results:TNF-α could perform the inhibitory effect of proliferation and induced the apoptosis of HCM cells, TNF-α also induced the degradation of PARP-1 protein and up-regulated expression ofPAPR-1gene in HCM cells (P＜0.05); The inhibit effect of proliferation and the apoptosis rate of HCM cells induced by TNF-α was decreased after the intervention of PARP-1 inhibitors (P＜0.05). The mRNA expression level ofPARP-1gene was down-regulated and the difference between the intervention group and the control group was not significantly in protein level.Conclusion:The effect of cells growth inhibition and apoptosis induced by TNF-α on HCM can be attenuated by blocking the activity of PARP-1 protein and gene transcription.

Key words:tumor necrosis factor-α; myocytes, cardiac; PARP-1 inhibitor; apoptosis

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子參與炎癥反應(yīng)，除了通過與其受體結(jié)合啟動炎癥免疫應(yīng)答，還可以作為獨立因素參與心肌損傷[1]。在心臟組織中多種損傷和炎癥均可促進(jìn)心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，如心肌梗死、缺血再灌注和慢性心衰等[2-3]。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]催化將NAD+中的多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移至DNA或蛋白受體中，這種翻譯后修飾參與了包括DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控等多種細(xì)胞過程[4-6]。有研究[7]證實PARP的過度活化可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)存儲的NAD+衰竭，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，本研究通過體外實驗研究PARP-1蛋白抑制劑干預(yù)TNF-α對人心肌細(xì)胞的生長抑制和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，為進(jìn)一步探討TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制和信號途徑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 人心肌細(xì)胞HCM細(xì)胞株購于南京凱基生物科技有限公司；重組TNF-α購于北京義翹神州生物科技有限公司；兔抗人PARP-1多克隆抗體（ab32064）和PARP-1蛋白抑制劑（4-Aminonaph-thalimide，ab144620）購于美國Abcam公司；兔抗人β-actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體、預(yù)染蛋白Marker、eECL試劑盒和Trizol試劑購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×Taq PCR Mastermix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase）、DNA Marker和BCA蛋白定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；MTT、DMEM培養(yǎng)基購于北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞抑制率：取對數(shù)生長期HCM細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×107個細(xì)胞/mL，取200 μL鋪種至96孔板，待貼壁后處理組加入不同濃度的TNF-α，干預(yù)組加入TNF-α的同時加入PARP-1抑制劑，對照組（即TNF-α濃度為0時）加入同體積的0.9%氯化鈉溶液，繼續(xù)培育24 h后加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培育4 h后去上清并加入150 μL DMSO，

充分混勻后用酶標(biāo)儀于492 nm處測吸光度，計算各組細(xì)胞的生長抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測PARP-1抑制劑干預(yù)后TNF-α對HCM細(xì)胞凋亡的影響：取對數(shù)生長期的HCM細(xì)胞，鋪種至6孔板，待貼壁后處理組加入不同濃度的TNF-α，干預(yù)組分別加入不同濃度的TNF-α和PARP-1抑制劑，繼續(xù)培育24 h后消化并懸浮細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書加入FITC-Annexin V和PI染料，避光孵育后用貝克曼流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測PARP-1基因表達(dá)：細(xì)胞處理方法同上述實驗，繼續(xù)培育24 h后收集細(xì)胞并用PBS清洗2次，加入1 mL的Trizol試劑充分混勻，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行RNA抽提，用無RNA酶水溶解后用核酸蛋白測定儀檢測RNA溶液的OD260/OD280以及OD260/OD230比值和RNA濃度，取等量的RNA溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄完成后用2×Taq PCR Mastermix配置PCR反應(yīng)液，并加入等體積的cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參β-actin基因的引物序列為：β-actin-F：5’-GCAC TCTTCCAGCCTTCCTT-3’，β-actin-R：5’-AGGTCTTTGCG GATGTCCA-3’，PARP-1基因的引物序列為：PARP-1-F：5’-AGCCTTCAGGAGTTGTTCTTAG-3’，PARP-1-R：5’-GAGTG TTCCAGTCCAGAATCA-3’。擴(kuò)增完成后用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照后用Image J軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，并計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測PARP-1蛋白的表達(dá)：細(xì)胞鋪種和藥物處理如同上述MTT實驗步驟，藥物處理0、6、12、18、24、32 h后加收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，通過BCA法測定總蛋白后取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、半干法轉(zhuǎn)膜、封閉，按照抗體說明書進(jìn)行比例稀釋一抗并于4 ℃孵育過夜，清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，清洗后用eECL試劑孵育醋酸纖維素膜，暗室中進(jìn)行曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖。結(jié)果以 ±s表示，各組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制率 MTT實驗結(jié)果顯示TNF-α可以抑制HCM細(xì)胞的生長，并呈濃度依賴性，其IC50濃度經(jīng)Graphpad prism 5軟件計算為235 ng/mL，見圖1。用235 ng/mL的TNF-α作用于HCM細(xì)胞的同時，加入不同濃度的PARP-1抑制劑進(jìn)行干預(yù)，24 h后MTT法檢測細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示干預(yù)組的細(xì)胞生長抑制率低于處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.2 細(xì)胞凋亡 不同的TNF-α濃度處理HCM細(xì)胞24 h后經(jīng)PE-Annexin-V和7-AAD雙染色后上機(jī)檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞主要以凋亡為主，并呈濃度依賴性，見圖3A。干預(yù)組中各濃度的TNF-α加入PARP-1抑制劑（100 ng/mL）干預(yù)后的細(xì)胞凋亡比率與相同濃度TNF-α處理組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖1 TNF-α對HCM細(xì)胞的生長抑制作用

圖2 不同濃度的PARP-1抑制劑干預(yù)TNF-α對HCM細(xì)胞的生長抑制作用

圖3 PARP-1蛋白抑制劑干預(yù)TNF-α對HCM細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

2.3PARP-1基因表達(dá) HCM細(xì)胞在TNF-α誘導(dǎo)后，通過RT-PCR分析PARP-1基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示100～250 ng/mL濃度的TNF-α誘導(dǎo)后PARP-1基因的mRNA表達(dá)水平明顯上升，與對照組（TNF-α濃度為0）比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；50 ng/mL濃度的TNF-α處理HCM細(xì)胞后PARP-1基因的mRNA表達(dá)水平與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4AB。PARP-1抑制劑（100 ng/mL）對TNF-α進(jìn)行干預(yù)，各個濃度的TNF-α處理HCM細(xì)胞后PARP-1基因的mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但加入PARP-1抑制劑的干預(yù)組中，各不同濃度TNF-α組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4C-D。

2.4 PARP-1蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示TNF-α處理HCM細(xì)胞后PARP-1蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，并呈濃度依賴性，但是PARP-1裂解產(chǎn)物cleaved-PARP-1的蛋白水平卻隨著TNF-α處理濃度增加而遞增，與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在加入100 ng/mL的PARP-1抑制劑的干預(yù)組中，不同濃度TNF-α處理HCM細(xì)胞后PARP-1和cleaved-PARP-1蛋白與對照組比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 不同濃度TNF-α以及PARP-1抑制劑干預(yù)對HCM細(xì)胞PARP-1基因表達(dá)的影響

3 討論

急性心肌梗死是一種由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致冠狀動脈血供急劇減少甚至中斷或血栓性阻塞，使得心肌嚴(yán)重或者持久地缺血，引起心肌細(xì)胞壞死的疾病。重癥醫(yī)學(xué)和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的發(fā)展實現(xiàn)了為患者盡早恢復(fù)血流供應(yīng)，但在恢復(fù)血流灌注的同時不可避免地會引發(fā)心肌缺血-再灌注損傷，導(dǎo)致各種并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和PARP-1蛋白在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中有著重要的作用。TNF-α作為參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的重要因子，在AMI發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，對動脈粥樣硬化患者發(fā)生心血管事件危險分層意義重大[8]。國內(nèi)學(xué)者通過米諾環(huán)素處理經(jīng)冠狀動脈左前降支結(jié)扎缺血/再灌注損傷模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素可能是通過抑制心肌細(xì)胞和外周血白細(xì)胞中PARP蛋白過度活化而減輕對大鼠心肌細(xì)胞損傷[9]，還有研究表明PARP-1蛋白抑制劑具有減少心肌梗死面積、減弱心肌功能障礙、促進(jìn)心臟停搏后心肌功能恢復(fù)等心肌保護(hù)作用[10-12]。

盡管以上文獻(xiàn)報道說明通過抑制PARP-1蛋白的活性具有保護(hù)心肌細(xì)胞的功能，但是其具體作用機(jī)制仍未闡明，因此，本研究通過TNF-α處理HCM人心肌細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，建立心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，干預(yù)組通過PARP-1抑制劑對心肌細(xì)胞凋亡壞死過程進(jìn)行干預(yù)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡壞死，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。實驗結(jié)果顯示不同濃度的TNF-α對HCM細(xì)胞具有一定的生長抑制作用，特別是終濃度為200 ng/mL條件下對HCM細(xì)胞的生長抑制作用明顯增強(qiáng)，但是通過PARP-1抑制劑干預(yù)后，明顯降低TNF-α對細(xì)胞生長抑制作用，并表現(xiàn)對PARP-1抑制劑具有濃度依賴性。細(xì)胞凋亡檢測實驗結(jié)果也顯示PARP-1抑制劑干預(yù)后Annexin-V陽性比例較未干預(yù)組有明顯降低。本研究還通過RT-PCR和Western blot實驗分析HCM細(xì)胞在不同濃度的TNF-α以及PARP-1抑制劑干預(yù)作用下PARP-1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示TNF-α可以誘導(dǎo)HCM細(xì)胞中PARP-1基因的mRNA上調(diào)表達(dá)，但是在蛋白表達(dá)水平上伴隨其裂解產(chǎn)物cleaver-PARP上調(diào)，PARP-1蛋白水平出現(xiàn)下調(diào)。在不同濃度的TNF-α處理HCM細(xì)胞的同時加入PARP-1抑制劑可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞中PARP-1基因的上調(diào)表達(dá)，并且在0 ng/mL的TNF-α處理組細(xì)胞中PARP-1基因同樣也出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但是對蛋白水平分析結(jié)果顯示PARP-1和cleaved-PARP的表達(dá)量與對照組相比未見明顯差異，但是在細(xì)胞增殖實驗和細(xì)胞凋亡實驗組中均發(fā)現(xiàn)PARP-1抑制劑對HCM細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有明顯的影響，因此推測TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中可能還存在其他信號途徑。

據(jù)文獻(xiàn)報道，TNF-α可以在無DNA損傷的情況下通過TNFR1/ERK2信號途徑介導(dǎo)PARP-1蛋白磷酸化從而激活PARP-1的酶活性，并且TNF-α在激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性過程中表現(xiàn)出對PARP-1的酶活性的依賴性[13]。還有學(xué)者通過對未經(jīng)LPS處理的小膠質(zhì)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)PARP-1可以持續(xù)與IL-1β和TNF-α的啟動子結(jié)合，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后ADP-核糖化作用將NF-κB招募至IL-1β和TNF-α的啟動子同源區(qū)從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)[14]。

圖5 處理組和干預(yù)組HCM細(xì)胞中PARP-1和cleaved-PARP-1表達(dá)

本研究結(jié)果提示TNF-α通過誘導(dǎo)HCM細(xì)胞PARP-1活化和蛋白裂解，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PARP-1抑制劑通過抑制PARP-1蛋白活化和基因的轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)TNF-α對HCM細(xì)胞的生長抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，但是具體的分子機(jī)制和參與的信號途徑，以及PARP-1抑制劑干預(yù)是否對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生影響均尚未闡明。盡管如此，PARP-1仍可能成為降低心肌梗死引起的缺血再灌注對心肌細(xì)胞損傷理想的靶標(biāo)。

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（本文編輯：趙翠翠）

PARP-1 protein inhibitor attenuated the growth inhibition and apoptosis of human cardiomyocytes in- duced by TNF-α

XIE Yuequn1, WANG Lei1, CHEN Linglong1, XU Ying1, YANG Zhitao2, LU Zhongqiu3.1.Department of Emergency, Wenzhou People’s Hospital, the Third Clinical Institute Affiliated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Emergency, Ruijin Hospital Shanghai JiaoTong University School of Medicine, Shanghai, 200025; 3.Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.006

2017-01-10

浙江省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新學(xué)科建設(shè)計劃項目（11-CX26）；浙江省中醫(yī)藥重點學(xué)科計劃項目（2012-XK-A28）；浙江省“十二五”重點學(xué)科建設(shè)項目（2012-207）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20170736）。

謝月群（1985-），女，浙江瑞安人，主治醫(yī)師，碩士。

盧中秋，主任醫(yī)師，Email：lzq640815@163.com。