趙燕云，項(xiàng)協(xié)隆，簡(jiǎn)怡娟，董飛俠，3

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 溫州 325000；3.溫州老年病醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

苯那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達(dá)的影響

趙燕云1，項(xiàng)協(xié)隆2，簡(jiǎn)怡娟2，董飛俠2，3

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 溫州 325000；3.溫州老年病醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

目的：觀察苯那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表達(dá)的影響，探討苯那普利對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法：將54只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、苯那普利組，每組18只。苯那普利組予1.6 mg/kg苯那普利灌胃給藥，每天1次，模型組、假手術(shù)組予10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次。模型組和苯那普利組大鼠均結(jié)扎左側(cè)輸尿管制備單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型。各組分別于造模第7、第14、第21天隨機(jī)處死6只大鼠，取左側(cè)腎臟組織做病理檢測(cè)，Masson法觀察腎纖維化程度，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4的表達(dá)，PCR檢測(cè)NOX4的表達(dá)情況。結(jié)果：與假手術(shù)組比，模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度加重，且隨著輸尿管梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而加重（P＜0.05）；與模型組比較，苯那普利組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度減輕（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色與PCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比，模型組腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；與模型組比，苯那普利組大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論：苯那普利能下調(diào)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管TGF-β1、α-SMA、NOX4的表達(dá)，可能是其抗腎纖維化作用的機(jī)制之一。

單側(cè)輸尿管結(jié)扎；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；α平滑肌肌動(dòng)蛋白；NADPH氧化酶；腎纖維化；苯那普利

Abstract: Objective:To observe the effects of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction (UUO) and investigate the mechanism of it in renal interstitial fibrosis.Methods:The male Sprague-Dawley (SD) rats (54 cases) were randomly divided into Sham-operated group, model group and Benazepril treated group, 18 rats in each group. The benazepril group was given 1.6 mg/kg intragastric administration 1 times a day, and the model group and the sham operation group were given 10 mL/kg 0.9% sodium chloride solution gavage 1 times a day, model group and the benazepril group were ligated left ureter to establish UUO models. At days 7, 14 and 21, six rats in each group were sacrificed. Their left surgery renal tissues were collected for pathological examination. The pathological changes of the obstruction renal tissue were examined by Masson staining. The protein and gene expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 was detected by immunohistochemical staining respectively and NOX4 was detected by RT-PCR.Results:Compared with the Sham-operation group, the renal interstitial fibrosis degree of rats in other groups was increased(P＜0.05), and aggratated as the ureteral obstruction time prolonged. Compared with the model group, after the treatment, the renal interstitial fibrosis degree decreased significantly (P＜0.05). Compared with the Sham-operation group, the protein expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in other group increased (P＜0.05). Compared with the model group, after the treatment by Benazepril, the protein expression TGF-β1, α-SMA, NOX4 was down-regulated in the renal tissue (P＜0.05). Conclusion: Benazepril may effectively retard kidney interstitial fibrosis by reducing the expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 to inhibit inflammatory of kidney.

Key words:unilateral ureteral obstruction; TGF-β1; α-SMA; NOX4; renal interstitial fibrosis; Benazepril

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）的全因死亡高危因素。干預(yù)早、中期的CKD對(duì)預(yù)防其進(jìn)展到ESRD尤其重要。腎臟纖維化是CKD進(jìn)展的共同通路，所以，抑制腎臟纖維化是CKD早、中期治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實(shí)NOX4信號(hào)通路在調(diào)節(jié)炎癥、抑制腎纖維化中發(fā)揮重要作用[1]。苯那普利通過(guò)抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），降低腎小球囊內(nèi)壓、高灌注、高濾過(guò)，延緩慢性腎臟病的進(jìn)展。本研究通過(guò)觀察苯那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎纖維化大鼠模型NOX4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1，）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的影響，探討其抗腎纖維化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，分籠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，人工光照，明暗各12 h，飼養(yǎng)期間進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.1.2 藥物與試劑：苯那普利（上海延慕實(shí)業(yè)有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1抗體（美國(guó)Santa公司）；兔抗大鼠α-SMA抗體、兔抗大鼠NOX4單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；GTVisionTM I I I抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆?；HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器：組織脫水機(jī)（KD-TS3A，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；病理切片機(jī)（RM2235，德國(guó)Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；電子天平（FA2004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；微量加樣槍（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥：54只SPF級(jí)雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=18）、模型組（n=18）和苯那普利組（n=18）。模型組和苯那普利組采用結(jié)扎單側(cè)輸尿管建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型：禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，以10%水合氯醛（3.5 μL/g）腹腔注射麻醉，取右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)，剪除左側(cè)腹部被毛，常規(guī)碘伏消毒，從背部距左側(cè)肋脊角1.5 cm處做1.2～1.5 cm的斜向切口，逐層剪開(kāi)皮膚、肌肉，開(kāi)腹后暴露左側(cè)腎臟，游離左輸尿管，分別于約腎盂處和輸尿管上1/3處雙重結(jié)扎，后納腎歸原位，然后逐層縫合。假手術(shù)組開(kāi)腹后分離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎[1]。造模后第2天開(kāi)始給藥，每日稱體質(zhì)量，假手術(shù)組、模型組予10 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，苯那普利組予苯那普利灌胃，劑量為1.6 mg/kg，每天1次。

1.2.2 標(biāo)本收集和處理：各組大鼠分別于給藥第7、第14、第21天后隨機(jī)取6只，禁食不禁水1 d后處死，取左腎，除去包膜，放出積水，迅速分切腎組織，將其中一份于中性甲醛溶液中固定，其余組織用0.9%氯化鈉溶液沖洗后迅速置于液氮中凍存，轉(zhuǎn)置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 大鼠一般情況：觀察各組大鼠造模后、給藥過(guò)程中的精神狀態(tài)、活動(dòng)度、體毛色澤以及大便形狀等情況。

1.3.2 Masson染色：取經(jīng)中性甲醛溶液固定24 h的腎臟組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm厚石蠟切片，按常規(guī)方法行Masson染色后進(jìn)行腎間質(zhì)纖維化指數(shù)評(píng)分：在400倍視野下，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的腎皮質(zhì)區(qū)腎小管間質(zhì)視野，計(jì)算視野中膠原染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比，然后取平均值。標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，纖維化陽(yáng)性面積＜2%；1分，纖維化陽(yáng)性面積2%～10%；2分，纖維化陽(yáng)性面積11%～20%；3分，纖維化陽(yáng)性面積21%～30%；4分，纖維化陽(yáng)性面積＞30%[2]。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織TGF-β1、α-SMA、NOX4表達(dá)。3 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鹽緩沖液（pH值6.0）中高壓煮沸修復(fù)抗原，加3% H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封閉液封閉30 min，滴加一抗，TGF-β1（1∶100）、α-SMA（1∶500）、抗NOX4（1∶100），4 ℃過(guò)夜；滴加聚合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察，棕黃色部分為陽(yáng)性染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)非重疊視野，使用Image Pro Plus軟件分析每張圖像中陽(yáng)性染色面積百分比，取其平均值作為本張切片的結(jié)果。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)腎組織NOX4 mRNA表達(dá)：提取腎組織總RNA后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)各組樣品RNA純度，以20 μL為體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以25 μL為反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)含25×SYBR Green I熒光染料1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水14.7 μL，cDNA 1.0 μL，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性90 s，退火5 s，58 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 ±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 假手術(shù)組大鼠術(shù)后第1天飲食飲水、活動(dòng)恢復(fù)正常，精力充沛，被毛光澤，大便正常；模型組大鼠術(shù)后飲食飲水、活動(dòng)度恢復(fù)較慢，精神欠佳，大便偏硬；苯那普利組大鼠術(shù)后3 d開(kāi)始恢復(fù)正常飲食飲水，精神尚可，活動(dòng)較假手術(shù)組稍少，大便軟。各組大鼠體毛肉眼觀察未見(jiàn)明顯區(qū)別，光澤度均可。

2.2 Masson染色 假手術(shù)組腎組織Masson染色未見(jiàn)明顯病理改變，僅見(jiàn)腎小管基膜處呈線狀分布的藍(lán)染的膠原組織。模型組隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，間質(zhì)中藍(lán)染的膠原纖維逐漸增多，提示纖維化進(jìn)行性加重。膠原半定量分析顯示，與假手術(shù)組比，模型組纖維化指數(shù)顯著增加（P＜0.05），隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，腎小管間質(zhì)纖維化逐漸加重（P＜0.05）。與模型組比，經(jīng)苯那普利治療后，腎纖維化指數(shù)減輕（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖1。2.3 TGF-β1表達(dá) 假手術(shù)組TGF-β1有微量表達(dá)，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞中TGF-β1均有不同程度的表達(dá)，在病變腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)更為顯著，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1所占陽(yáng)性面積百分比逐漸加重，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組比較，苯那普利組TGF-β1表達(dá)均有降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間的腎間質(zhì)纖維化指數(shù)（n=6， ±s）

圖1 Masson染色評(píng)價(jià)腎間質(zhì)纖維化情況（×400）

表2 各組大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性面積百分比（n=6，±s，%）

圖2 各組腎組織中TGF-β1的表達(dá)（×400）

2.4 α-SMA的表達(dá) 在假手術(shù)組中，僅見(jiàn)小動(dòng)脈層中表達(dá)棕褐色的α-SMA，腎間質(zhì)中未見(jiàn)表達(dá)。模型組可見(jiàn)腎間質(zhì)中出現(xiàn)大量α-SMA表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，各模型組腎間質(zhì)α-SMA的表達(dá)量增加，且均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組比，經(jīng)苯那普利治療后表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖3。

表3 各組大鼠腎間質(zhì)中α-SMA表達(dá)陽(yáng)性面積百分比（n=6，±s，%）

2.5 NOX4的表達(dá) 假手術(shù)組腎組織中只有少量NOX4表達(dá)，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組NOX4的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比，苯那普利組NOX4表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖4。

表4 各組腎組織中NOX4表達(dá)陽(yáng)性面積百分比（n=6，±s，%）

2.6 NOX4 mRNA表達(dá) 各組大鼠腎臟均有NOX4 mRNA表達(dá)，假手術(shù)組有較弱表達(dá)，模型組、苯那普利組大鼠腎組織表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。苯那普利組表達(dá)較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

圖3 各組腎組織中α-SMA的表達(dá)（×400）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)成年人群CKD的患病率高達(dá)10.8%，并呈逐年上升趨勢(shì)[1]。腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟病的基本病理基礎(chǔ)，與腎小球硬化相比，腎間質(zhì)纖維化與腎功能減退關(guān)系更為密切[2]。腎纖維化是慢性腎臟病發(fā)展至終末期的共同途徑，TGF-β1在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TGF-β1啟動(dòng)并調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的全過(guò)程，是腎纖化過(guò)程的中心介導(dǎo)者和主要途徑[3-4]。α-SMA是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的指標(biāo)，是肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志[5]，是腎纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最重要的因子之一[6]。本研究結(jié)果顯示，造模后TGF-β1、α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)，且隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加，表明模型組大鼠發(fā)生了上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度加重；經(jīng)過(guò)苯那普利治療后，TGF-β1、α-SMA表達(dá)量降低。已有研究表明苯那普利是通過(guò)下調(diào)TGF-β1、α-SMA蛋白水平的表達(dá)從而抗上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用[7-8]。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）密切相關(guān)，阻斷RAS對(duì)腎有保護(hù)作用。苯那普利對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶有較強(qiáng)的抑制作用，引起血漿血管緊張素I I（angio-tensin，Ang I I）濃度減低，并導(dǎo)致血漿腎素活性增加和醛固酮水平降低，抑制Ang I I在腎臟的血流動(dòng)力學(xué)及非血流動(dòng)力學(xué)的作用，特別是Ang I I也可以刺激NOX的多個(gè)亞基使之激活，產(chǎn)生ROS以及H2O2，并導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS的積聚，而ROS又可以作為Ang I I的信號(hào)分子去執(zhí)行Ang I I的細(xì)胞毒性作用[9]，從而抑制NOX的多個(gè)亞基激活，緩解腎纖維化進(jìn)展。NOX有7種亞型，分別為NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[10]，在腎組織中表達(dá)的主要是NOX4，主要在腎小管中表達(dá)，可能作為一種敏感性氧感受器。RAAS的激活促進(jìn)NOX4產(chǎn)生過(guò)量的ROS，氧化應(yīng)激的水平升高，促進(jìn)腎纖維化，NOX產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)Ang I I、TGF-β1、蛋白激酶C促腎纖維化，與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[11]。本研究結(jié)果表明，苯那普利通過(guò)抑制RAS激活，抑制Ang I I水平，下調(diào)NOX4的基因表達(dá)；苯那普利組與模型組比，病理腎間質(zhì)纖維化指數(shù)降低，表明苯那普利除了抑制Ang I I在腎臟的血流動(dòng)力學(xué)作用，同時(shí)從非血流動(dòng)力學(xué)方面，下調(diào)NOX4的表達(dá)，減輕氧化損傷，改善UUO腎臟病理，改善腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

圖4 各組腎組織中NOX4的表達(dá)（×400）

表5 各組大鼠腎間質(zhì)中NOX4 mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=6，±s）

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（本文編輯：趙翠翠）

Effect of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA and NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction

ZHAO Yanyun1, XIANG Xielong2, JIAN Yijuan2, DONG Feixia2,3. 1.Department ofPharmacology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Nephrology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 3.Department of Nephrology, Wenzhou Geriatric Hospital, Wenzhou, 325000

R966

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.005

2017-03-20

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14H270001）；浙江省中醫(yī)藥管理局課題（2013ZB121）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20170692）。

趙燕云（1973-），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，副主任藥師。

董飛俠，主任醫(yī)師，Email：cgrsfhtd@163.com。